石头鱼毒素胶体金检测试纸条的研制

目的：研制石头鱼毒素（neoverrucotoxin,stonefish toxin,neoVTX）的胶体金检测试纸条,建立一种该毒素的快速检测方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,以neoVTX马血清抗体用于胶体金标记,并将该抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗体夹心法原理制备胶体金检测试纸条。结果制备的检测试纸条对该毒素检测灵敏度为50 ng／ml,该试纸与牛血清白蛋白、卵清蛋白及水母毒素等蛋白无反应,具有较好的特异性。结论成功研制了石头鱼毒素胶体金检测试纸,该试纸条灵敏度高,特异性好,可用于该毒素的快速检测。     

表达SARS冠状病毒受体人ACE2转基因小鼠的建立

目的:建立表达SARS冠状病毒的功能性受体人ACE2的转基因小鼠.方法:克隆人2型血管紧张素转换酶(hACE2)的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,以显微注射的方法将5.6 kb的转基因片段引入小鼠的受精卵.采用PCR、Southern印迹、RT-PCR、Western印迹、免疫荧光染色的方法对转基因小鼠进行鉴定.结果与结论:获得了在小鼠肺组织中表达有SARS病毒功能性受体hACE2的两个转基因小鼠系,证明了SARS病毒的S蛋白能很好地和转基因小鼠肺组织中表达的hACE2受体结合,这将为SARS的研究提供一种良好的感染动物模型.     

α-芋螺毒素Lt1.1的克隆、合成及靶点鉴定

目的 发现作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂,为研制新型镇痛药和神经生物学工具奠定基础.方法 根据芋螺毒素A超家族DNA中保守的内含子及3′端非转录区(3′UTR)设计引物,从中国南海信号芋螺(Conus litteratus)中克隆获得新芋螺毒素Lt1.1序列.固相法合成Rink树脂肽,经裂解、空气氧化折叠、纯化后获得目的肽,利用两步氧化折叠法鉴定其二硫键连接方式.将神经元nAChR各亚基的cRNA在爪蟾卵母细胞中表达,利用双电极电压钳检测通道电流.结果 获得一种新α-芋螺毒素Lt1.1序列(GCCSHPACNVNNPDIC-NH2),其二硫键连接方式为"C1-C3、C2-C4",作用靶点为nAChR α3β2和α3β4亚型,IC50 分别为166.76和190.00 nmol/L.结论 Lt1.1是一种典型的4/7型α-芋螺毒素,其选择性抑制了nAChR α3β2和α3β4亚型.     

新A超家族芋螺毒素Bt14.10的克隆及合成研究

目的从我国南海西沙附近海域的桶形芋螺（Conus betulinus）中克隆出新型A-超家族芋螺毒素Bt14.10,并利用化学方法合成该毒素,鉴定其二硫键连接方式。方法提取桶形芋螺毒腺管基因组DNA,基于非翻译区及内含子序列设计合成引物进行PCR,获得Bt14.10的序列。采用Fmoc-固相法合成线性肽Bt14.10,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式。结果发现一种新的A超家族芋螺毒素DNA序列Bt14.10,其编码的成熟肽序列为CAHSVPGMHPCKCNNTC-NH2,二硫键连接方式为＂C1-C3,C2-C4＂。结论BT14.10是一种新型A超家族芋螺毒素,具有A超家族芋螺毒素较为少见的ⅪⅤ型半胱氨酸骨架结构。     

新的M家族芋螺毒素的克隆及进化分析

目的从中国南海芋螺中寻找新的M家族芋螺毒素。方法应用3′RACE及巢式PCR进行基因克隆,将得到的目的基因连接入pGM-T载体、转化并测序,用进化分析软件对得到的新序列进行进化分析。结果从6种芋螺毒腺管中获得8个新的M家族芋螺毒素前体肽序列,其成熟肽含有15~21个氨基酸残基。结论这些新的M族毒素与已报道的M家族毒素序列同源性较低,是Mini-M家族的新成员。     

不同电融合和激活参数对猪体细胞核移植胚胎发育的影响

目的：摸索猪体细胞核移植最佳的融合和激活条件.方法：利用体外成熟的去核猪卵母细胞为受体,颗粒细胞为供核细胞,透明带间隙注射法构建重构胚,对电融合和激活的参数（电场强度、脉冲宽度、脉冲次数、融合液中Ca^2＋浓度、联合激活参数）进行摸索.结果：发现在电场强度1.5 kV/cm,脉冲宽度30 μs,2次脉冲（间隔3 s）,电融合液中0.1 mmol/L的Ca^2＋浓度下进行电激活,进而用（CB,7.5 μg/ml）＋（6-DMAP,2 mmol/L）激活3.5 h发育率最高,48 h卵裂率为72.5%,第6天桑葚胚率为35.1%;初次尝试了在胚胎培养前48 h加入0.05 mol/L的甘露醇来增加渗透压以减少电激活后重构胚的碎片化程度,但发现卵裂率及桑葚胚发育率与对照组差异不显著.结论：初步得到了适宜的猪体细胞核移植的融合和激活条件,为随后克隆胚早期发育基因的研究打下了基础.     

双抗体夹心ELISA法检测石头鱼毒素

目的 建立石头鱼毒素neoVTX的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,为该毒素的检测、中毒诊断及治疗提供依据.方法 以过碘酸钠法偶联马抗-HRP,利用双抗体夹心ELISA方法检测neoVTX.结果 该法的线性范围在磷酸盐缓冲液(PBS)中为4～512 ng/ml,线性回归方程为Y=1.676X-1.140(r2=0.9728,n=8,P＜0.0001),在血浆中检测线性范围为4～2048 ng/ml,线性回归方程为y=0.3094X-0.1208(r2=0.9907,n=10,P＜0.0001).牛血清白蛋白、卵清蛋白及人血浆对检测结果无干扰.结论 成功建立了石头鱼毒素的双抗体夹心ELISA检测方法,该法有较高的灵敏度和特异性,适用于溶液中及血浆中微量neoVTX的样品分析.     

马尔堡病毒GP蛋白高抗原性片段筛选及免疫性研究

目的 从马尔堡病毒GP蛋白上寻找与GP免疫原性相当的小片段用于疫苗设计,以克服全长蛋白缺陷.方法 基于GP(aa:1～681)结构及功能分区,构建3个片段[GP1△(aa:25～239)、GPM(aa:250～520)、GP2△(aa:436～648)],经原核表达后免疫小鼠,不同时间检测血清特异抗体滴度,检测脾淋巴细胞增殖指数及测定细胞因子浓度.结果 ELISA检测结果显示,GP2△组与GP混合组(GP1△+ GPM+GP2△)产生体液免疫能力相当,明显高于GP1△与GPM组(P<0.05);ConA非特异刺激后,GP2△组脾淋巴细胞的SI值高于GP混合组(P<0.05),GP混合组特异刺激后,GP2△组脾淋巴细胞的刺激指数(SI)值低于GP混合组(P<0.05);细胞因子检测中,GP2△组的白细胞介素2(IL-2)及干扰素γ(IFN-γ)浓度均高于对照组,低于GP混合组(P<0.05).结论 马尔堡病毒GP2△片段免疫小鼠能诱导与完整GP蛋白相当的体液免疫,同时也能诱导一定的细胞免疫, 可用来替代完整GP用于疫苗设计.