α-芋螺毒素Lt1.1的克隆、合成及靶点鉴定

目的 发现作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂,为研制新型镇痛药和神经生物学工具奠定基础.方法 根据芋螺毒素A超家族DNA中保守的内含子及3′端非转录区(3′UTR)设计引物,从中国南海信号芋螺(Conus litteratus)中克隆获得新芋螺毒素Lt1.1序列.固相法合成Rink树脂肽,经裂解、空气氧化折叠、纯化后获得目的肽,利用两步氧化折叠法鉴定其二硫键连接方式.将神经元nAChR各亚基的cRNA在爪蟾卵母细胞中表达,利用双电极电压钳检测通道电流.结果 获得一种新α-芋螺毒素Lt1.1序列(GCCSHPACNVNNPDIC-NH2),其二硫键连接方式为"C1-C3、C2-C4",作用靶点为nAChR α3β2和α3β4亚型,IC50 分别为166.76和190.00 nmol/L.结论 Lt1.1是一种典型的4/7型α-芋螺毒素,其选择性抑制了nAChR α3β2和α3β4亚型.     

中国南海新型α-芋螺毒素Im1.6的克隆及合成

目的从中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3'端快速扩增方法(3'RACE),从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Im1.6,其编码的成熟肽序列为GCCDIPDCYNKNREQC-NH2,二硫键连接方式为C1-C3,C2-C4。结论 Im1.6是一种新的α4/7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-芋螺毒素显著不同。     

中国南海新型甜芋α-螺毒素Iml．6的克隆及合成、

目的从中国南海堂皇芋螺（Conusimperialis）中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3’端快速扩增方法（3’RACE）,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Iml．6,其编码的成熟肽序列为GccDIPDCYNKNREQc—NH：,二硫键连接方式为“c1．c3,c2．C4”。结论Iml．6是一种新的α4／7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-一芋螺毒素显著不同。     

基于无细胞蛋白合成系统体外合成芋螺毒素µ-PⅢA

目的 利用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统(CFPS)体外合成芋螺毒素Mu-conotoxin PⅢA(μ-PⅢA).方法 通过PCR扩增芋螺毒素μ-PⅢA肽前体3种肽段(信号肽、前体肽与成熟肽)不同组合的DNA片段,将其分别克隆到pIVEX-2.4d载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定后得到阳性克隆.在大肠杆菌CFPS体系中加入芋螺毒素μ-PⅢA体外合成所需反应液以及重组表达质粒并开始反应.最后用Western印迹对合成的芋螺毒素μ-PⅢA进行鉴定.结果 双酶切和基因测序表明,pI-p3a1、pI-p3a2和pI-p3a3原核表达质粒均构建成功,Western印迹结果表明,通过CFPS体外合成出芋螺毒素μ-PⅢA.结论 应用CFPS实现了芋螺毒素μ-PⅢA的可溶性表达,为芋螺毒素翻译后修饰机制研究奠定了实验基础.     

新的M家族芋螺毒素的克隆及进化分析

目的从中国南海芋螺中寻找新的M家族芋螺毒素。方法应用3′RACE及巢式PCR进行基因克隆,将得到的目的基因连接入pGM-T载体、转化并测序,用进化分析软件对得到的新序列进行进化分析。结果从6种芋螺毒腺管中获得8个新的M家族芋螺毒素前体肽序列,其成熟肽含有15~21个氨基酸残基。结论这些新的M族毒素与已报道的M家族毒素序列同源性较低,是Mini-M家族的新成员。     

ω—芋螺毒素MVⅡA的合成改进及碘标记

ω－芋螺毒素ＭＶⅡＡ是由２５个氨基酸、三对二硫键组成的小肽（ＣＫＧＫＧＡＫＣＳＲＬＭＹＤＣＣＴＧＳＣＲＳＧＫＣ－ＮＨ２）,由Ｏｌｉｖｅｒａ等从幻芋螺毒液中分离〔１〕。ＭＶⅡＡ可选择性抑制Ｎ型电压敏感性钙通道,广泛用作神经生物学探针并具有多种药物发展前景,作为无致瘾性镇痛剂及神经损伤保护剂已进入Ⅱ～Ⅲ期临床〔２〕。ＭＶⅡＡ合成的关键是线性肽正确折叠。目前,文献中主要采用含ＤＴＴ、盐酸胍的醋酸铵及含半胱氨酸、盐酸胍的磷酸盐折叠体系〔３〕,实验中我们观察到,前者折叠效率并不高,且折叠时间过长,后者在折…     

α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C融合蛋白的制备及其抗血清活性研究

目的 制备α-芋螺毒素GI抗血清,为其中毒救治提供有效手段.方法 构建包含α-芋螺毒素GI、PADRE和破伤风毒素C片段(TTC)融合蛋白的原核表达载体,原核表达GI-PADRE-TFC融合蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体滴度,并测定其对小鼠的抗毒活性.结果 获得GI-TTC融合蛋白69.5 mg.GI-TTC融合蛋白免疫小鼠第5次免疫后血清对GI、GI-BSA的抗体滴度分别达到1∶102400及1∶204800.100、200 μl融合蛋白抗血清对2.0×LD50的α-芋螺毒素GI中毒小鼠存活率分别为14.3％、25.0％,且小鼠死亡时间显著延长.结论 α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C片段的融合蛋白具有较好的免疫原性,其产生的抗血清对α-芋螺毒素GI具有一定中和活性.     

艰难梭菌毒素AC端结构域在大肠杆菌中的可溶性表达与卵黄抗体的制备

目的重组表达艰难梭菌毒素A的C端结构域,制备针对艰难梭菌毒素A C端结构域的卵黄抗体。方法将优化合成的艰难梭菌毒素A的C端结构域DNA片段克隆到表达载体pET32b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌中诱导表达,经高亲和镍离子树脂纯化得到融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。检测目的蛋白的生物学活性,用目的蛋白免疫产蛋鸡制备针对艰难梭菌毒素A受体结合区的鸡卵黄抗体,分离纯化鸡卵黄抗体并用ELISA测定卵黄抗体的效价。结果获得了优化的艰难梭菌毒素A受体结合区的基因片段,继而制备了具有生物学活性的毒素A C端结构域重组蛋白。免疫产蛋鸡后获得了效价1∶50 000的抗艰难梭菌毒素A的卵黄抗体。结论获得了具有生物学活性的艰难梭菌毒素A C端结构域重组蛋白,为建立艰难梭菌基因工程疫苗打下了基础,并制备了针对艰难梭菌毒素蛋白A的卵黄抗体,可用于艰难梭菌相关性腹泻的诊断和治疗。     

肿瘤坏死因子受体短肽配体的筛选

目的利用噬菌体六肽库筛选肿瘤坏死因子(TNF)受体的短肽配体。方法利用可溶性TNF受体Ⅰ(sTNFRⅠ)蛋白筛选噬菌体随机六肽库，经过4轮筛选和酶联免疫吸附测定，获得能和sTNFR相结合的噬菌体克隆。对部分阳性噬菌体克隆进行DNA测序，推算出相应的氨基酸序列，并进行保守性分析。按其中的保守序列进行多肽设计、合成，通过细胞学实验鉴定其生物活性。结果得到30个可模拟TNF的阳性克隆，对其中6个进行单链DNA测序和分析。合成和纯化短肽(八肽)WH701，体外细胞毒实验结果证实了该序列的有效性。结论获得了可模拟TNF受体亲和力的短肽配体，为研制新的TNF受体显像多肽配基提供了实验依据。     

SO3—一种新型具镇痛活性的芋螺多肽

目的：通过对中国南海线纹芋螺毒素的基因克隆、多肽的化学合成 量筛选,获得一种具有镇痛作用的芋螺多肽SO3。该太含有25个氨基酸残基CKAAGKPCSRIATNCCTGSCRSGKC－NH2,三对二硫键,其作用靶位为N型钙通道。方法：小鼠采用侧脑室给药,每只20μl。小鼠镇痛活性采用热板法、光热辐法及扭体法测定,大鼠采用脊髓鞘内套管给药,每只10μl,大鼠镇痛活性采用烫尾法及尾部压痛法。结果：生物活性测这表明该肽对小鼠的镇痛活性ED50为0．75μg/kg,对小鼠的急性毒性试验LD50为13．5mg/kg.LD50比ED50大18000倍,具有很高的用药安全性。论：国外已进入Ⅱ-Ⅲ期临床实验的ω－芋螺毒素MVIIA进行对照实验的结果表明两者活性相当,SO3毒副作用更低,而且作用靶位与MVIIA类似,无成瘾性。SO3具有诱人的药物发展前景。     

低剂量CT扫描结合迭代算法重建行颞骨成像

目的：探讨颞骨低剂量CT扫描结合迭代算法（iDose 3）行颞骨成像的可行性及其最佳参数。方法：以成年尸头为研究对象,应用飞利浦256层CT,采用螺旋扫描模式,分别在电压120 kV、100 kV和80 kV时用不同的管电流时间乘积进行颞骨扫描,从250 mAs 开始,间隔30 mAs 逐次降低,直至图像较差不能满足诊断时终止扫描,重建算法采用iDose level 3,滤过函数Y-sharp（C）。两位医生采用5分制评分标准对16个解剖结构进行评估。比较所有图像的图像质量及辐射剂量。结果：“100 kV＋70 mAs＋iDose level 3＋Y-sharp（C）”的成像组合是良好显示解剖结构的最低剂量组合,有效剂量约0．15 mSv。结论：颞骨低剂量扫描切实可行,“100 kV＋70 mAs＋iDose level 3＋ Y-sharp（C）”是最低剂量扫描方案。     

64排螺旋CT在成人肠套叠诊断中的应用价值

目的：探讨64排螺旋CT对成人肠套叠的诊断价值。方法收集我院2012年1月至2013年12月经手术病理证实的13例成人肠套叠,并对其CT平扫及7例增强表现进行回顾性分析。结果13例中均可见套叠头体部呈现分层鞘状软组织影,其中8例见“靶征”,2例见“腊肠征”,2例见“肾形”,1例见不规则肿块改变;7例增强扫描时可见肠壁的各种形态改变,诸如有无缺血水肿、坏死,并判定血管并发症的严重程度等征象。结论 CT平扫及增强扫描对成人肠套叠的定性及定位诊断有重要的价值。     

分化型甲状腺癌术后131I治疗患者胸腺生理性摄取131I的临床研究

目的 探讨分化型甲状腺癌（DTC）术后131I治疗患者胸腺生理性摄取131I的临床特点及131I全身显像（WBS）的影像学特征.方法 收集2007年至2013年收治的1882例次DTC术后131I治疗后第3～5天行WBS的患者,分析WBS上纵隔部位有131I摄取,并根据甲状腺球蛋白、甲状腺球蛋白抗体测定、其他影像学检查及临床随访结果最终被证实为胸腺生理性摄取131I的患者资料.结果 胸腺生理性摄取131I者共16例,年龄均＜45岁,其中有15例患者至少接受过2次131I治疗,仅有1例第1次131I治疗后胸腺显影;WBS上胸腺生理性摄取131I主要表现为“弥漫性”或“哑铃状”浓聚灶;且胸腺对131I的生理性摄取随重复131I治疗次数的增加而越来越明显.结论 胸腺生理性摄取131I是45岁以下DTC术后患者多次131I治疗后WBS假阳性的重要原因之一,充分认识到这一现象并予以鉴别,对于患者下一步的恰当诊治是十分必要的.     

男性新兵进驻高原3个月后认知功能改变研究

目的：探讨高海拔驻防3个月对军人认知功能的影响。方法采用自身前后配对的设计方法,对37名新兵进驻4400 m海拔3个月后的认知功能指标,即反应时、速度知觉、时间知觉、手臂稳定性、记忆广度、深度知觉、短时记忆、注意广度进行了对比研究。结果受试者4400 m海拔驻防3个月后,其运动时缩短（ P＜0．05）;速度感更为准确;记忆广度、短时记忆均轻微下降（ P＜0．05）;深度知觉误差加大,且更易出现近点远移现象。结论3个月高海拔环境驻防对军人的多种认知功能造成不同程度损伤,尤其对反应运动时、深度知觉及记忆能力的损伤较为明显。     

全身多骨及皮肤受侵的Gorham-Stout综合征1例报告并文献复习

目的：提高对Gorham-Stout综合征的认识。方法报告1例下颌骨、肋骨、双手（足）多骨及皮肤受侵的Gorham-Stout综合征患者,结合文献对其临床特征进行探讨。结果DR片示右侧下颌支、多根肋骨、双手（足）多发中远节指（趾）骨质吸收溶解,残端呈“削笔尖”状,溶骨区无骨膜反应;CT结合二维及三维重建直观地显示了骨质破坏的范围、周围软组织萎缩;MRI见残留的右侧下颌小头周围少许长T1、T2异常信号渗出影环绕。肋骨及胸膜穿刺活检病理见成骨细胞明显减少,而血管和纤维组织增生。结论Gorham-Stout综合征是一种以大块骨质溶解为特征的罕见病,影像学及病理结合临床有助于发现该病。