人骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定及标记

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养、鉴定和标记的方法以及生物学特性。方法无菌条件下穿刺人髂后上嵴抽取骨髓,采用直接贴壁法分离纯化hMSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的hMSCs进行鉴定,同时检测第3代和同代溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记的hMSCs细胞周期。结果体外培养的原代hMSCs在培养24小时内可见少量贴壁细胞,7天达到融合,免疫细胞化学示CD44和CDl05表达阳性,CD34表达阴性,流式细胞仪示CD44阳性率为89．64％,CD34为0．11％。大部分hMSCs核抗BrdU染色阳性,阳性率达90％。细胞周期显示第3代和同代BrdU标记的hMSCs约有90％的细胞处于G0／GI期,第10代为80％。结论hMSCs在体外很容易分离培养和扩增,但随着传代次数的增加,hMSCs变得宽大扁平且增殖速度减慢,出现衰老现象;用BrdU标记hMSCs对其细胞周期无明显影响,可作为标记细胞的一种有效手段。     

雷公藤内酯醇对胆囊癌GBC-SD细胞株增殖与凋亡的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇(TP)对体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞株增殖和凋亡的影响.方法 体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞,分别加入0、5、10、20、50、100ng/ml(终浓度)TP,24、48、72h后采用MTT测定细胞生长抑制率,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布情况.结果 随剂量增加和作用时间延长,TP对GBC-SD的增殖抑制作用增强.TP不仅能引起细胞形态的变化,而且能诱导GBC-SD细胞凋亡,改变细胞周期分布.结论 TP能诱导胆囊癌细胞凋亡,并抑制其增殖,从而发挥抗肿瘤作用.     

兔骨髓间质干细胞的体外生物学特性及超微结构研究

目的 对兔骨髓问质干细胞进行体外分离培养并观察其生物学特性.方法 无菌条件下抽取健康幼年新西兰兔胫骨骨髓2ml,经密度梯度离心后获取骨髓间质十细胞,接种至100ml玻璃培养瓶中进行体外培养,观察其细胞形态、贴壁率和超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标记物及细胞生长周期,并进行成骨诱导反向证明,对细胞体外的生物学行为进行研究.结果 兔骨髓间质干细胞在体外培养2h后开始贴壁,20h后细胞基本贴壁完全,15d左右细胞融合达90%以上.透射电镜观察显示分离培养的兔骨髓问质干细胞表面可见许多微绒毛,主要分布于胞体一侧,胞核不规则,有切迹,细胞器丰富,具有典型未分化细胞特点;流式细胞仪检测显示分离培养的兔骨髓间质干细胞表面标记物CD44、CD90表达呈阳性,CD4S表达呈阴性,且绝大多数(约占细胞总数的97%)细胞的生长周期处于G1或G2期;成骨性诱导3周后,骨髓间质干细胞逐渐形成小的钙盐结晶体,细胞碱性磷酸酶染色阳性,VonKossa染色显示细胞聚集处存在大量钙盐,呈黑色沉积.结论 密度梯度离心法获取的兔骨髓问质干细胞纯度较高,生长稳定,传代多次后仍保持干细胞特性,因取材及体外扩增较简单易行,适合作为组织工程椎间盘髓核退变缺损修复的种子细胞来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及示踪优化

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记和示踪方法,优化示踪技术。方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原(CD29、CD34、CD45、CD90),分别用BrdU、DAPI以及GFP 3种方法标记干细胞,DAPI和GFP标记率直接通过荧光显微镜进行鉴定,BrdU标记率通过细胞免疫化学法鉴定,比较3种示踪技术的优缺点。结果流式细胞仪鉴定结果显示MSCs CD29、CD90表达阳性,CD34、CD45表达阴性。3种标记方法对细胞均未显示明显毒性。终浓度10μmol/L BrdU标记48h、终浓度1μg/ml DAPI标记12h分别为其最佳标记浓度及时间。感染复数MOI=8时,GFP慢病毒感染MSCs 12h,感染率可达90%以上。结论 GFP基因转染是一种稳定、可靠、安全的标记方法,对成体干细胞的示踪有重要价值。     

乳鼠心肌细胞的体外培养及生物学特性研究

目的 探讨乳鼠心肌细胞的体外培养方法并对其生物学特性进行观察.方法 1～3日龄新生SD大鼠10只,用无酶消化法行含血清培养基原代心肌细胞培养,连续观察细胞生长及传代情况40天.α-横纹肌肌动蛋白抗体标记培养细胞,以流式细胞仪行心肌细胞纯度鉴定,Giemsa染色观察培养心肌细胞形态,吖啶橙-碘化丙啶(AO-PI)染色法检测培养细胞活性.记录培养心肌细胞总数,计算单个乳鼠心脏细胞产量.结果 原代组织块和单个心肌细胞在接种后24～48h贴壁,其中部分出现搏动并持续至观察期末.培养细胞群鉴定心肌细胞纯度为94.1%,活细胞比例95.3%,95%可信区间(CI)为91.6%～99.0%.平均每个乳鼠心脏单细胞产量为3.3×106个,95% CI为2.1×106～4.5×106个.结论 无酶消化法培养的乳鼠心肌细胞纯度、活力及产量能够满足心肌细胞研究的需要.     

肝细胞生长因子与表皮细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）与表皮细胞生长因子（EGF）联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为类肝细胞的可行性。方法取大鼠股骨骨髓，用直接贴壁法分离纯化Mats并体外传代，实验组用HGF（20mg／m1）＋EGF（10mg／m1）对体外培养的Mscs进行诱导分化。细胞免疫化学法及流式细胞仪对培养的MSCS进行鉴定。RT-PCR检测诱导后慨的AFP、AIb、CK-18的mRNA表达。电镜观察诱导细胞的超微结构。结果贴壁的MSCs单个存在或形成克隆，细胞形态比较均一，为长梭形，7～10天达汇合。免疫细胞化学及流式细胞仪均证明培养的细胞为MSCs。实验组MSCS在培养21天时表现为类肝细胞的形态特点。RT-PCR：AFP mRNA在第7天呈阳性表达，AIb mRNA及CK-18 mRNA开始即有表达，21天增强。电镜观察见诱导21天的Mats形态结构与肝细胞相吻合。结论Mats在体外容易分离培养和扩增，HGF＋EGF可诱导MSCs向类肝细胞分化，为细胞移植治疗肝衰竭提供新的探索思路。     

Resovist标记内皮祖细胞及1.5T磁共振成像的体外研究

目的确定Resovist体外标记内皮祖细胞(EPCs)的最佳条件,并探讨1.5T磁共振体外示踪标记细胞的方法。方法采用密度梯度离心法从人脐带血中分离、培养、鉴定EPCs,以不同浓度(0、10、25、50、751、00μg/ml)Resovist标记EPCs,分别检测细胞的标记效率、增殖活性、迁移能力及成血管能力,并采用1.5T磁共振对标记的EPCs进行体外成像观察。结果普鲁士蓝检测表明细胞标记效率随Resovist浓度增加而增高,在50μg/ml浓度时已接近95%。透射电镜观察可见胞质内高密度物质聚集。MTT结果表明75、100μg/ml的Resovist可显著抑制EPCs的增殖活力、迁移能力和成血管能力,且100μg/ml浓度的抑制作用大于75μg/ml浓度(P<0.05)。1.5T磁共振成像显示,10μg/ml Resovist标记后EPCs在T2加权像上即呈低信号,与对照组比较差异显著(P<0.01),且浓度越高信号差异越明显。结论采用Resovist可简单高效标记EPCs,且不影响细胞的生物学特性,并能在1.5T磁共振下进行示踪,其最佳标记浓度为25~50μg/ml。     

甘遂提取物对肿瘤瘤株Hep、S180的抑制作用观察

目的观察甘遂提取物作用于小鼠移植瘤细胞Hep、S180后的抑制作用。方法模型组、5-Fu组、甘遂提取物组（E）、5-Fu＋E组,每组10只小鼠分别于右前肢腋皮下接种瘤中注射Tween80溶液、5-Fu、甘遂提取物、甘遂提取物＋5-Fu。免疫组化检测Bcl-2表达。体外培养S180细胞,加入药物浓度为50μg/ml、10μg/ml、1μg/ml,培养48h,流式细胞仪测细胞凋亡率。结果模型组与各实验组移植癌和移植癌组织与药物注射引起肿瘤坏死的Bcl-2蛋白表达,在统计学上有显著差别（P〈0.05）。加入药物浓度为50μg/ml、10μg/ml、1μg/ml,流式细胞仪测定凋亡率分别为33.9%、28.8%和23.3%。结论中药甘遂对Hep、S180有明显的抑制作用。     

大鼠间充质干细胞的体外分离培养及CFSE标记

目的 探讨体外分离、培养及荧光染料CFSE标记大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法.方法 Wistar大鼠10只.用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定.荧光染料CFSE标记MSCs,荧光显微镜检测标记率,CCK-8法检测标记细胞的增殖能力.结果 原代MSCs 72h贴壁,呈梭形,集落样生长;传代后,细胞变为形态均一,排列有序的成纤维细胞样.CFSE标记当天,荧光显微镜下大鼠MSCs呈明亮的绿色荧光,标记率达100%,随着培养时间延长,荧光强度逐渐减弱,标记率随之下降,标记4周后,标记率下降至78%;标记细胞的增殖能力与未标记细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;CFSE短期标记MSCs效率很高,且标记细胞的增殖能力不受影响,但荧光强度及标记率随着时间延长而下降.     

法舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

 目的探讨HA-1077(fasudil,法舒地尔)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的影响.方法采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2,采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测,观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响.结果采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs,分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞,随着时间延长,阳性率逐渐提高.7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5/8、CK10/13、CK19阳性率均远高于诱导组(P＜0.01).结论HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升,Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用.     

促红细胞生成素和甲泼尼龙对损伤星形胶质细胞增殖的影响

目的研究在促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）和甲泼尼龙（Methylprednisolone,MPSS）干预下对损伤星形胶质细胞增殖的影响,探讨EPO和MPSS联合应用在脊髓损伤中的作用。方法取自SD大鼠大脑原代培养星形胶质细胞,缺营养培养3h后分别在促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）和甲泼尼龙（erythropoietin,EPO）的培养基中培养24、48小时后,MTT法检测星形胶质细胞增殖活性的变化。结果缺营养可抑制星形胶质细胞增殖,促红细胞生成素和甲泼尼龙对正常细胞增殖无明显影响作用,EPO和MPSS均促进损伤细胞增殖,两者联合减量应用对细胞增殖有明显影响作用。结论 EPO＋MPSS（半量组）联合减量应用对星形胶质细胞增殖作用表达的升高作用优于单独应用甲泼尼龙。     

溶血磷脂酸酰基转移酶β促进人肺成纤维细胞的增殖、迁移与黏附

目的分析溶血磷脂酸酰基转移酶p（1ysophosphatidic acid acyltransferase,LPAATp）在多种细胞系中的表达情况及其过表达对细胞体外增殖、迁移与黏附的影响。方法通过免疫印迹实验检测LPAATp在多种细胞中的表达水平;构建pcDNA3．1A（＋）／LPAATB真核表达载体,转染人肺成纤维细胞（humanlung fibroblast,HLF）并筛选稳定转染细胞株;通过MTY细胞增殖实验分析过表达LPAATB对HLF细胞体外增殖的作用,通过划痕修复实验分析稳定株细胞的体外迁移能力,利用细胞黏附实验分析稳定株细胞对细胞外基质成分Matrigel的黏附情况。结果LPAAT8蛋白在肿瘤细胞中表达水平存在差异。体外生物学实验显示,稳定转染LPAATB的HLF细胞增殖能力明显增强,细胞迁移能力显著提高,与细胞外基质成分Matrigel的黏附能力显著增强。结论LPAAT家族成员LPAAT8在人类多种细胞中的表达具有普遍性,其过表达明显促进HLF细胞的增殖、迁移及黏附能力,提示该基因在细胞体外生长过程中具有重要作用。     

皮肤merkel细胞癌扁桃体转移1例并文献回顾

目的：探讨皮肤Merke!细胞癌的诊断及鉴别诊断、治疗及预后。方法：对1例皮肤Merkel细胞癌扁桃体转移患者的临床病史、肿瘤组织的病理免疫组化表达及治疗过程进行回顾性分析,并结合相关文献就其临床特征及转移方式进行讨论。结果：本例Merkel细胞癌患者表现为臀部merkel细胞癌,于术后5个月发生附近淋巴结转移,再次手术后出现远处转移。手术后2年,发现右颌下包块,咽部不适,扁桃体活检证实扁桃体小细胞神经内分泌癌;免疫组化EMA（＋）NSE（4-）CK、CgA、Vim、ICA均（-）。结论：Merkel细胞癌罕见且进展快,即使综合治疗后仍有局部复发和远处转移的倾向,预后差。诊断主要依靠病理,免疫组化染色有助于鉴别诊断。临床上需结合病史与扁桃体原发癌相鉴别。     

以人胎肝基质细胞为饲养层有效扩增脐带血CD34~＋细胞

目的以人胎肝基质细胞（fetal liver stromal cell,FLSC）作为饲养层,进行脐带血CD34＋细胞的扩增培养,寻找更加有效的体外扩增方法。方法比较脐带血CD34＋细胞在无饲养层和人FLSC饲养层条件下,培养7,13,15d的细胞增殖状况;并利用流式细胞仪检测不同时间点CD34＋细胞的比例。结果随着培养时间的延长,脐带血CD34＋细胞的扩增呈现时间依赖性改变;在FLSC饲养层条件下,CD34＋细胞培养7,13,15d的扩增数量分别为（11.83±0.76）×105,（14.37±0.32）×105和（18.73±0.25）×105,而在无饲养层条件下的扩增数量分别为（2.90±0.10）×105,（8.87±0.15）×105和（11.97±0.15）×105,两者相比有显著性差异（P（0.01）;此外,流式细胞仪检测各时间点CD34＋细胞的比例,在培养第13天,FLSC饲养层条件下CD34＋细胞的比例为10.21%,而在无饲养层为1.01%,两者存在显著差异。结论以人FLSC作为饲养层可以有效扩增脐带血造血干/祖细胞,为今后临床造血干细胞移植提供充足的细胞来源。     

地黄低聚糖对脂肪间充质干细胞增殖的影响

目的分离培养人脂肪源性间充质干细胞（human adipose tissue—derived mesenchymal stromal cells，hADMSCs），探讨地黄低聚糖对其体外增殖的影响。方法腹部外科手术患者术后废弃的脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化后培养，免疫组织化学方法鉴定其表面分子CD44、CD105、CD45、CD34的表达，鉴定细胞为hADMSCs后，应用不同浓度的地黄低聚糖IMDM（1、10、100、400mg·L^-1）体外培养hADMSCs，应用MTT比色法检测RGOs对ADMSCs增殖能力的影响。结果1、10mg·L^-1组与对照组相比无显著性差别，100、400mg·L^-1组的地黄低聚糖培养基对hADMSCs的增殖有明显的促进作用，且100mg·L^-1 RGOs的促hADMSCs增殖作用最强（P〈0．01）。结论一定浓度的地黄低聚糖对hADMSCs的增殖能力具有促进作用。     

不同病期银屑病皮损组织中Merkel细胞超微结构变化和表达CK20的研究

目的探索不同病期银屑病患者皮损组织中Merkel细胞超微结构变化和表达CK20的情况,研究银屑病Merkel细胞结构和功能的变化规律。方法选择经过不正规治疗、新老皮损同时存在的银屑病患者25例,获取皮损旁的正常皮肤组织（相当于发病前期）、皮损组织（相当于进展期）和皮损修复后的病灶皮肤组织（相当于治愈期）,电子显微镜观察Merkel细胞的超微结构,免疫组化法检测皮损中CK20的表达情况。结果进展期皮损组织中Merkel细胞核相对于发病前期和治愈期无明显变化,但皮损组织Merkel细胞质中神经内分泌颗粒数量进展期组高于另两组（P〈0．05）,而另两组间差异无显著性意义（P〉0．05）。进展期皮损组织CK20表达高于发病前期和治愈期（P〈0．05）;治愈期皮损组织CK20表达与发病前期相当（P〉0．05）。结论银屑病发病与Merkel细胞结构无关,与Merkel细胞数量或表达CK20的高低可能有一定相关性。     

激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究

目的研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法取人肾小管上皮细胞株进行体外培养,分为ACT—A组（含不同浓度激活素A）、FS组（含不同浓度卯泡抑素）、ACT—A＋Fs组（含30ng／mlACT＋不同浓度卵泡抑素）和对照组（含无血清培养基及0ng／mlACT—A和0ng／mlFS）,应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白（TGF—β）的表达,以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果与对照组和卵泡抑素组相比,激活素组。肾小管—巳皮细胞表达的TGF-β蛋白显著增多（P〈0．05）。结论激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化,激活素A可能在肾小管问质纤维化中起重要作用。     

瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSCs,制备正常及瘀胆大鼠血清,取第3代MSCs分组培养：A组：DMEM＋10％FBS;B组：肝细胞生长培养基（HGM）＋5％FBS0、组：HGM＋5％正常大鼠血清;D组：HGM＋5％瘀胆大鼠血清;E纽：HGM＋5％瘀胆大鼠血清＋25ug／LHGF。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用RT～PCR检测甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白18（CK18）的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白（ALB）的含量。结果培养过程中,D、E组出现多角形及双核细胞,A、B、C组细胞形态无明显变化。生长曲线显示细胞生长速度C组最快,D、E组均较B组快（P〈0．05）。D、E组于诱导第7,14天出现AFPmRNA阳性表达,第14,21天出现CK18mRNA阳性表达,D、E组上清波中白蛋白浓度随诱导时间延长逐渐升高,且E组高于D组（P〈0．05）。A、B、C组未见AFP、CK18表达及白蛋白浓度变化。结论正常大鼠血清能明显促进MSCs的增殖;瘀胆血清对MSCs有一定促增殖作用,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用HGF能提高分化率。     

木醋杆菌纤维素对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原含量的影响

目的研究木醋杆菌纤维素对人皮肤成纤维细胞（HSFb）的增殖及胶原蛋白合成的影响．探讨其促进创面愈合的可能机制。方法体外培养的HSFb随机分为2组,1组为实验组与木醋杆菌纤维素敷料共同培养．1组设为空白对照组。应用流式细胞仪检测细胞周期变化,应用碱水解法检测培养液中羟脯氨酸的含量变化,检测2组HSFb培养72h后的培养上清液中I型与Ⅲ型胶原含量及其比值的变化。结果细胞周期时项分析结果显示实验组细胞周期S＋G州期细胞百分率及增殖指数PI值较空白组增高（P〈0．05）。实验组在不同时间段时其成纤维细胞培养液中羟脯氨酸含量均明显高于空白组（P〈0．05）。实验组与空白组比较,培养上清液中I型与Ⅲ型胶原含量增高,I型与Ⅲ型胶原比值下降（P〈O．05）。结论木醋杆菌纤维素能有效促进人皮肤成纤维细胞的增殖和胶原的合成,可能与其促进创面愈合的机制有关。     

抗肿瘤干细胞药物体外活性评价方法

目的以乳腺癌MCF-7细胞和盐霉素钠为例,建立体外抗癌干细胞药物活性评价的简单方法。方法无血清、含有生长因子的DMEM/F12培养基培养MCF-7细胞,观察细胞的生长及体外干细胞球形成能力;流式细胞仪检测CD44+/CD24-细胞含量;将无血清培养的、富集的MCF-7干细胞以不同的数量接种到Nu/Nu裸鼠皮下,观察并检验致瘤能力;CCK-8法检测药物对悬浮乳状球样细胞生长的作用。结果用无血清、含有生长因子的DMEM/F12培养基培养的MCF-7细胞,增殖缓慢,呈悬浮乳状球样;流式细胞仪检测CD44+/CD24-细胞含量,10%胎牛血清的RPMI1640培养的MCF-7干细胞为(12.8±0.6)%,无血清培养的MCF-7干细胞为(97.1±2.4)%;裸鼠接种无血清培养的、富集的MCF-7干细胞约100个细胞即可见肿瘤生成。盐霉素钠对无血清培养条件下的富含癌干细胞的MCF-7细胞有较高的毒性。结论所获得的CD44+/CD24-细胞具有乳腺癌干细胞特性,且超低黏附培养板和无血清环境可以促进悬浮球状细胞团的形成,CCK-8法是一种简便的体外评价抗癌干细胞药物的检测方法。