转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球对干细胞的调控

文题释义：转化生长因子β3：是转化生长因子β超家族成员,在胚胎软骨形成的多个时期都是必不可少的软骨组织形成的关键调节因子,可以促进间充质干细胞迁移并诱导其向软骨组织分化与成熟,促进软骨缺损的愈合。 聚乳酸-羟基乙酸微球：属于食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的可生物降解聚合物,具有可控的降解性和良好的生物相容性,被广泛应用于医药领域。由于其生物可降解性,聚乳酸-羟基乙酸微球微球被广泛应用于小分子药物、蛋白质和其他大分子药物的可控持续释放。 背景：转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球系统可使药物在作用部位维持有效药物浓度,提高生长因子的利用率。 目的：优化转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球制备工艺,探究其对脂肪间充质干细胞增殖和迁移的影响。 方法：采用乳化-溶剂挥发法制备转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球,并对微球的形态、粒径大小、药物空间分布、包封率、载药量和缓释性能进行表征。将转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球溶解于PBS中,于相应的时间点检测上清液中转化生长因子β3浓度,对应时间点扫描电镜观察微球形态。将脂肪间充质干细胞分6组培养,分别加入培养基(阴性对照)、含转化生长因子β3的培养基、含空白聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基、含10,100,1 000 g/L转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基,于对应的时间点CCK-8法检测增殖。将脂肪间充质干细胞分别与培养基(阴性对照)、含转化生长因子β3的培养基、含聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基、含10,100,1 000 g/L转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基以非接触方式共培养24 h,检测细胞迁移数量。结果与结论：①转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球呈球形,表面光滑,无粘连,粒径均匀分布,微球直径2-50 μm,微球内的蛋白药物分布均匀,具有较高的包封率与载药量;②缓释微球具有良好的降解性能,体外可于6个月后完全降解;同时具有良好的缓释性能,体外可缓慢释放转化生长因子β3长达45 d;③空白微球及含转化生长因子β3的缓释微球对脂肪间充质干细胞增殖无影响;④空白微球对脂肪间充质干细胞的迁移无影响,转化生长因子β3及含转化生长因子β3的缓释微球可促进脂肪间充质干细胞的迁移,不同质量浓度缓释微球间的促进效果无差异;⑤结果表明,转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球可在不影响脂肪间充质干细胞增殖的情况下促进其迁移。 ORCID: 0000-0002-2267-4589(杨振) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响

目的观察人脱细胞软骨细胞外基质(hACAM)对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质,配制成0.5%的浆料,分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板,形成1 mm厚的薄膜,以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否;分别在第5、15天两个时间点,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况,用CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组,甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点;CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0298),hACAM组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。结论 hACAM免疫原性低,无细胞毒性,能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。     

骨骺软骨细胞的培养和保存方法

目的建立大量生产骨骺软骨细胞的培养方法和保存方法,为组织工程骺软骨的培养提供种子细胞。方法2周龄兔胫骨上端骨骺软骨经机械剪切和化学消化后,接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现,并通过蕃红花“O”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色对其生物学特征进行鉴定。结果在体外观察到了骨骺软骨细胞从静止、增殖到肥大这个近似体内的生长过程,经多次传代后增殖能力降低,经过冻存的细胞生物学特征不变。蕃红花“O”和Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论我们成功地建立了骨骺软骨细胞的培养和冻存方法,并证明培养出的细胞是骨骺软骨细胞。     

原位定量评价组织工程研究中细胞生长状态的新方法

目的探讨一种能原位定量评定细胞在高分子聚合物载体上生长情况的方法。方法采用CFDA-AM和PI双染结合激光扫描共聚焦显微镜技术,用平均荧光强度代表细胞数量,对组织工程骺软骨中骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上1、2及3周时的死活细胞数量进行评价。结果骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上的530nm的平均荧光强度随时间逐渐增加,而603nm的荧光强度在第2周时有所增加,而到第3周时则无明显增加。与细胞在载体上重量增加的结果一致。结论首次采用的原位定量检测载体上死活细胞的方法是可行的,解决了在不透明载体上即不影响细胞和载体结构,而可以原位快速定量评定细胞生长的难题。     

柠檬酸化半水硫酸钙作为骨移植替代材料的安全性及生物相容性评价

目的：以二水硫酸钙为原料，制备出高纯度柠檬酸化半水硫酸钙，并对其生物相容性进行评价。方法：实验于2004-09／2005-01在解放军总医院骨科研究所完成。柠檬酸化半水硫酸钙粉沫是粉状的二水硫酸钙经特殊处理制得。根据文献对实验材料进行生物相容性及安全性评价实验。①红细胞溶解性：材料粉末制备的浸提液加入抗凝兔血内恒温水浴60min、离心取上清液，分光光度计测定上清液吸光度。计算红细胞溶血率（％）=（实验组吸光度-阴性对照组吸光度）／（阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度）&;#215;100％、标准：≤5％为正常。②细胞毒性试验：采用四甲基偶氮唑盐比色法。兔骨髓基质干细胞经复苏、传代、培养24h后进行更换含材料浸提液的培养基继续培养、酶标仪测定1，3，5，7d吸光度。计算细胞相对增值率=实验组吸光度／对照组吸光度。③细胞材料表面贴附：骨髓基质干细胞细胞悬液滴在材料表面，培养3d后，倒置显微镜下观察材料边缘细胞生长情况。乙醇固定后用环境扫描电镜镜下观察材料表面的细胞贴附情况。④热源性：自体温试验筛选合格新西兰家兔的耳缘静脉注入材料浸提液后，定时测兔体温。标准：每只体温升高在0．6℃以下，3只体温升高总度数小于1．4℃。⑤皮肤刺激性：健康新西兰家兔脊柱两侧选点注射材料花生油及DMEM浸提液，每个点注射0．2mL。观察注射部位皮肤反应。⑥致敏性：将浸提液与完全氟氏佐剂完全乳化制成相应剂型试剂，以豚鼠为观察对象，观察腹部激发部位皮肤反应。结果：①材料特性：制备材料2h固化抗压缩强度达到26MPa，初凝时间5rain，终凝时间20min。扫描电镜观察为晶体形态均一、为规则的六面体结构。②细胞粘附与生长形态：骨髓基质干细胞在材料周围生长．环境扫描电镜观察细胞贴附材料表面生长，呈不规则的梭形、多角形，胞体伸出伪足长短不等。③红细胞溶解实验：红细胞溶血率为0．34％，远小于阳性标准，说明材料植入体内后不会引起机体本身的溶血反应。④热源反应：家兔平均体温升高为0．1℃，符合医用材料的热源反应要求，说明本材料本身不具有致热源作用。⑤皮内注射：两组浸提液皮内注射后均未引起家兔实验区的红斑及水肿反应，提示材料对动物机体没有刺激性。⑥致敏实验：致敏率为0，与阴性对照没有差别，说明材料没有致敏性。⑦细胞毒性实验的检测结果提示实验组细胞相对增值率和对照组无显著性差别，评分为0～1级，说明材料本身不具有细胞毒性。结论：生物安全性评价结果初步显示制备的材料具有良好的生物相容性，符合医用生物材料的基本要求。     

多媒体数字化系统在细胞生物技术研究中的应用

目的 在细胞生物学研究中，利用先进的多媒体技术对传统的图像资料采集方法进行改革，提高资料采集、储存和保管的质量。方法 实验于2002-02／2004-05在解放军总医院全军骨科研究所完成。利用计算机、数码照相机、扫描仪、刻录仪、计算机图像采集系统、彩色激光打印机及各种软件收集和再现各方面的信息资料，按研究目的制作不同数据库及多媒体文件，建立影像资料库，简化资料的处理过程。结果 2002-02起建立细胞生物学多媒体数字化系统，截至2004-05，累计采集图像16万张，相关资料容量60G。结论 此套系统效率高，成本低，技术易掌握，资料分类、保存、查找容易，便于医学科研工作。     

肌腱玻璃化法冷冻保存的体外实验

目的:目前临床上常用低温冷冻法来保存同种异体肌腱,但操作较复杂费时,并且所保存的肌腱活性较低而限制其应用。采用已筛选的玻璃化法冷冻保存鸡屈趾深肌腱,并将复温后的玻璃化肌腱进行体外检测,探索其作为肌腱移植材料的可行性。方法:实验于2003-11/2005-02在解放军总医院骨科研究所完成。①实验材料及分组:来亨鸡16只,雄性,体质量2.5kg左右,随机分为2组,玻璃化组为玻璃化肌腱,新鲜肌腱组为新鲜肌腱,每组8只。②实验过程:切取来亨鸡屈趾深肌腱,置入玻璃化液内快速投入液氮保存2周制备玻璃化肌腱。③实验评估:将2组肌腱在体外进行大体、组织学及超微结构观察,羟脯氨酸含量测定,生物力学性能检测,并对两组肌腱进行细胞培养与鉴定。结果:①玻璃化组肌腱的大体、组织学及超微结构与新鲜肌腱组相似,其细胞及细胞外结构得以良好保存。②应用碱解法测定玻璃化肌腱内的羟脯氨酸含量为69.27mg/g,与新鲜肌腱组间差异无统计学意义。③玻璃化组肌腱破裂强度为165.58MPa,弹性模量1.41GPa,与新鲜肌腱组的力学性能差异无统计学意义。④将玻璃化组肌腱进行细胞培养,细胞第8天自组织块长出,第21天后传代,培养3代后出现明显的退化现象,其生物学特性与新鲜肌腱组相似。⑤将两组肌腱培养的细胞分别进行免疫组织化学染色,经鉴定均为肌腱细胞。结论:玻璃化法保存的肌腱具有良好的细胞活性、细胞外结构及力学性能,其生物学及生物力学特性无明显变异。     

取向性关节软骨细胞外基质源性支架对负载软骨细胞生物学行为的影响

目的：观察取向性关节软骨细胞外基质源性支架对负载软骨细胞的黏附、增殖、分布及排列的影响。方法：利用定向结晶及冷冻干燥技术制备猪关节软骨细胞外基质源性取向支架。分离、培养犬关节软骨细胞,接种在支架上体外培养,CCK-8试剂盒检测细胞在支架上的黏附和增殖,倒置显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及H＆E染色观察软骨细胞在支架上的形态、分布和排列情况,并以接种在非取向支架上的软骨细胞的生物学特性作为对照。结果：软骨细胞在两种支架上均能较好的黏附生长,大部分细胞呈圆球形;但在取向支架上增殖比在非取向支架上快（P〈0.05）;并且在取向性支架上软骨细胞能沿着支架孔道的取向性生长,在支架内部分布均匀,类似天然软骨组织的柱状结构;而在非取向性支架内软骨细胞呈无序排列,分布不均匀,支架内部细胞数量较少。结论：取向性软骨细胞外基质源性支架利于软骨细胞黏附、增殖,能引导软骨细胞分布排列呈类似于天然软骨细胞的柱状排列方式,是一种较理想的软骨组织工程支架。     

骨局部植入型硫酸钙/庆大霉素释放系统的生物相容性

背景：国外商品化的硫酸钙产品尽管临床应用效果较好，但存在依赖进口和价格较高的缺陷。 目的：自行构建骨植入型硫酸钙/庆大霉素药物释放系统，并评价其生物相容性。 设计、时间及地点：观察对比实验，于2005-10/2006-09在解放军总医院骨科研究所完成。 材料：以自制柠檬酸化半水硫酸钙为庆大霉素的载药基质，制备硫酸钙/庆大霉素植入剂抗生素含量5%。 方法：根据医疗器械生物学评价实验选择指南（ISO标准10993-1，1997）和国家标准GB/T16886-1选择红细胞溶血实验、细胞毒性实验、热原实验、肌肉内植入实验及骨内植入实验评价硫酸钙/庆大霉素抗生素释放系统的生物相容性。 主要观察指标：红细胞溶血率、细胞相对增殖率、体温升高情况及组织相容性。 结果：①抗生素释放系统红细胞溶血率为2.02%，小于阳性标准。②细胞毒性实验：实验组细胞相对增殖率和对照组无显著性差别，毒性评分为0~1级。③热原反应：家兔平均体温升高为0.3 ℃，符合医用材料的热源反应要求。④肌肉内植入实验：抗生素释放系统在肌肉组织内可逐渐降解，材料周围未见大量炎性细胞浸润，组织无排斥。⑤骨内植入实验：骨组织内抗生素释放系统可逐步降解，并逐渐被骨性组织替代，无排斥现象及肝肾毒性。 结论：构建的硫酸钙/庆大霉素释放系统不会引起机体本身的溶血反应，不具有细胞毒性和致热源作用，可逐步降解，无排斥现象，具有良好的生物相容性和安全性。     

自体软骨细胞修复关节软骨缺损的机制探讨

目的:观察团块样自体软骨细胞植入关节软骨缺损后的病理变化,探讨自体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的病理生理机制。方法:24只3.0kg以上4～6月龄新西兰大白兔,雌雄不限,随机分为两组:实验组和对照组。实验组12只,20%的速眠新(1mg/kg)肌肉注射麻醉后取肩关节软骨组织,0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离软骨细胞,体外单层培养,细胞长成肉眼可见的膜状后收集固体的组织样细胞团,动物再次麻醉制造双膝股骨滑车4.0mm×6.0mm方形缺损,植入细胞团块,骨膜覆盖,缝合骨膜于双股骨髁上。对照组12只,同实验组手术方法进行缺损单纯骨膜移植。1、3、12、24周两组各3只动物空气栓塞处死取材,观察细胞团块变化和缺损修复情况。结果:1周时软骨细胞朝向关节面部分细胞变大变圆,产生大量基质;3周时此种变化更加明显,但骨膜与细胞团块已然不能分开;12周时缺损为类透明软骨组织修复;24周时修复组织为透明软骨样组织,对照组为纤维软骨组织修复。结论:关节软骨细胞体外聚集培养形成的细胞团块内的细胞有迁移生长能力;细胞团块移植方法植入的细胞数量大,表型好,细胞在缺损内不会流失;关节软骨缺损修复是由植入的细胞团块生长分化而来;自体关节软骨细胞团块植入关节缺损内后,在关节应力的影响下,先从朝向关节面的一侧逐渐发生细胞成熟分化和软骨基质产生,逐渐完成缺损的修复。