ABRO1研究进展

ABRO1（Abraxas Brother 1）,也称为KIAA0157或FAM175B,是BRISC去泛素化酶复合体的一个重要组分,该复合体的主要功能是特异性剪切K－63链接的多聚泛素链。该文系统综述了ABRO1的结构特点,参与BRISC复合体组成及调节去泛素化酶活性、调控干扰素应答、参与氧化应激反应和抗心肌缺血等多方面的研究进展,为进一步研究ABRO1的生理功能及与免疫、心血管疾病的关联提供新思路。     

去泛素化酶USP13在癌症中的研究进展

泛素特异性蛋白酶13(USP13)是USP去泛素化酶家族成员之一,属于半胱氨酸蛋白酶超家族.USP13通过介导底物去泛素化过程,抑制底物泛素-蛋白酶体途径降解,进而参与细胞周期、自噬、天然免疫等多种生理过程的调节.近年来,关于USP13是癌症发生的重要调节因子的报道越来越受到关注.该文系统综述了USP13调控不同癌症的分子机制及研究现状,为靶向USP13治疗相关癌症提供新思路.     

蛋白泛素途径及其非降解功能研究新进展

泛素化是单个或多个泛素在泛素激活酶、泛素结合酶及泛素蛋白连接酶的作用下共价修饰底物蛋白质的过程。在蛋白质降解的过程中，泛素化标记被蛋白水解酶体特异性识别，发挥着枢纽的作用。而近年来的研究发现。泛素化不仅仅是蛋白质降解的标志，它有更为广泛的用途，参与了大量的生命活动。这些研究极大地丰富了对泛素化蛋白水解系统的认识，也使得在分子水平上对蛋白质降解异常导致的顽疾进行治疗不再是梦想。     

HECT类泛素连接酶Smurf1自身调控机制的研究

目的泛素连接酶Smurf1在胚胎发育、骨形成调控和细胞极性控制中具有重要的生理功能,但是其自身的泛素化降解机制尚不清楚。本论文拟研究Smurf1分子间自我调控的机制,以期揭示一种新的泛素连接酶调控方式。方法通过免疫共沉淀实验确证了Smurf1分子间存在相互作用,体内泛素化、半衰期及降解实验研究了Smurf1的自身泛素化降解。结果 Smurf1存在分子间相互作用和泛素化降解,这种分子间的相互调控是由C2和WW结构域介导。结论 Smurf1分子间存在自我泛素化修饰及蛋白酶体依赖的降解,是一种新的HECT类泛素连接酶的调控机制。     

MARCH1:一种新的树突细胞功能调控者

近期研究发现树突细胞(DCs)表面MHC-Ⅱ类分子的含量是通过MHC-Ⅱ类分子β链的泛素化水平来调控的[1],而MARCH1,一种E3泛素连接酶,在这一过程中起关键性的作用.但目前MARCH1在体内如何调控MHC-Ⅱ类分子的表达尚不清楚.研究表明,许多生理学上重要的受体都是细胞表面跨膜蛋白,与相应的配体发生作用后表达下调以避免对细胞的过度刺激.在很多情况下,表达的下调是通过受体的降解来完成的.表皮生长因子(EGF)受体即为其中的一种,研究发现泛素化是该受体降解过程中一种重要的蛋白修饰方式,E3泛素连接酶c-Cbl被认为是EGF受体泛素化的关键酶[2 3].近年来有学者证实泛素化对于免疫应答相关膜蛋白的稳态具有重要作用,许多生物学作用过程中涉及的膜蛋白均受泛素化调控[4 7].     

慢性肾衰竭血清对兔主动脉内皮细胞泛素-蛋白酶体途径的影响

目的 研究慢性肾衰竭(CRF)血清对兔主动脉内皮细胞泛素-蛋白酶体途径的影响,初步探讨CRF血清对主动脉内皮细胞作用的可能机制.方法 建立CRF兔模型,建模后12周,取CRF模型兔及正常兔下腔静脉血血清备用.原代培养健康兔主动脉内皮细胞,用正常兔血清或CRF兔血清刺激后,分别采用RT-PCR、Western blotting及特异底物反应法检测不同血清对主动脉内皮细胞泛素化蛋白、泛素激活酶(简称E1)mRNA表达,泛素化蛋白、E1、κB抑制因子(IκB)蛋白表达及蛋白酶体活性的影响.结果 CRF血清使主动脉内皮细胞泛素、E1 mRNA表达增加,明显高于正常血清(P<0.01).CRF血清对主动脉内皮细胞泛素化蛋白的表达无明显影响,但使E1蛋白表达增加,使蛋白酶体20S亚基活性增强,明显高于正常血清(P<0.01).CRF血清使主动脉内皮细胞IκB蛋白表达降低,与正常血清相比,差异有统计学意义(P<0.01).结论 CRF血清可致兔主动脉内皮细胞泛素-蛋白酶体途径活化,进而影响NF-κB信号通路.     

SPIO标记影响干细胞内IRPs/IREs系统的研究进展

铁是人体内含量最多的一种必须微量元素,它广泛参与机体内的代谢过程,在细胞生命活动中起着至关重要的作用。人体内的铁主要用于血红素蛋白及非血红素蛋白的合成,包括血红蛋白、肌红蛋白、呼吸链的主要复合体、细胞色素酶和过氧化物酶等,在人体内参与氧的运输、细胞内电子传递及能量代谢等过程[1]。     

严重烫伤大鼠骨骼肌泛素基因表达的变化

烧伤后机体蛋白质分解代谢增强 ,超过合成代谢 ,造成负氮平衡。本室研究表明 ,依赖三磷酸腺苷及泛素的 2 6Ｓ蛋白酶复合体 (ＡＴＰ -ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ - 2 6Ｓｐｒｏ ｔｅａｓｏｍｅ)系统为烫伤后骨骼肌蛋白质降解的主要途径[1 ] ,且烫伤后泛素含量呈明显的进行性增加。笔者拟应用皮肤全层烫伤大鼠模型观察多聚泛素ｍＲＮＡ水平的变化 ,以探讨骨骼肌泛素基因表达的变化与蛋白质代谢的相关性。一、材料与方法1.实验动物 :雄性健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠40只 ,体重 ( 15 0± 2 0 )ｇ ,本校动物所提供。2 .动物分组及处理 :随机分为正常对照组及烫…     

CUL4A-DDB1细胞稳定株筛选及DNA双链断裂模型构建

目的为了鉴定并验证CUL4A-DDB1泛素连接酶复合体中参与DNA损伤修复反应过程的1～2种关键成分在损伤识别、早期及晚期修复中的动态变化,拟构建含有串联亲和纯化（TAP）标签载体并筛选高表达CUL4A/DDB1的细胞株,建立DNA双链断裂模型。方法利用PCR获得CUL4A/DDB1基因,构建重组表达载体pNTAP-A-CUL4A/DDB1;使用顺铂和电离辐射刺激等外界刺激建立合适的DNA双链断裂细胞模型,使用G418筛选稳定表达CUL4A/DDB1的细胞株。结果与结论成功构建pNTAP-A-CUL4A/DDB1表达载体,建立合适的DNA双链断裂细胞模型,筛选得到稳定表达CUL4A/DDB1的细胞稳定株,为下一步质谱分析CUL4A-DDB1泛素连接酶在DNA损伤修复过程中的新功能打下基础。     

TAK1赖氨酸158位点发生Lys 63连接多聚泛素化在辐射诱导NF-κB激活过程中的作用

目的 研究转化生长因子激酶1(TAK1)Lys 63连接多聚泛素化在辐射导致的NF-κB激活过程中起到的作用及其作用位点。方法 通过基因瞬时转染技术将FLAG-TAK1和HA-Ub-K63质粒共同转染至HEK-293T细胞,应用免疫沉淀和免疫印迹技术研究辐射对TAK1泛素化的影响;用稳定转染TAK1表达的HeLa细胞,证实辐射对TAK1泛素化的影响。通过免疫印迹技术,比较分析辐射对稳定转染TAK1 K158R的MEF细胞与TAK1野生型MEF细胞比较分析辐射对它表达IKKs、p38及JNK的影响,以证明辐射诱导的TAK1-Lys 63多聚泛素化的位点是否在TAK1赖氨酸158位点。结果 瞬时转染的HEK-293T细胞接受辐射后1 h开始出现明显的TAK1泛素化表现,2 h更明显。在稳定表达FLAG-TAK1的 HeLa细胞系中得到证实。与TAK1野生型MEF细胞相比,TAK1 K158R突变的MEF细胞中辐射诱导的IKKs和 p38 磷酸化作用减低。结论 TAK1多聚泛素化在辐射导致的NF-κB激活过程中起到关键作用,辐射所致TAK1-Lys 63连接多聚泛素化发生在TAK1的赖氨酸158位点。     

Establishment of CUL4A /DDB1 stable expression cell strain and cell models responding to DNA damage

目的 为了鉴定并验证CUL4A-DDB1泛素连接酶复合体中参与DNA损伤修复反应过程的1~2种关键成分在损伤识别、早期及晚期修复中的动态变化,拟构建含有串联亲和纯化(TAP)标签载体并筛选高表达CUL4A/ DDB1的细胞株,建立DNA双链断裂模型.方法 利用PCR获得CUL4A/DDB1基因,构建重组表达载体pNTAP-A-CUL4A/ DDB1;使用顺铂和电离辐射刺激等外界刺激建立合适的DNA双链断裂细胞模型,使用G418筛选稳定表达CUL4A/ DDB1的细胞株.结果 与结论 成功构建pNTAP-A-CUL4A/ DDB1表达载体,建立合适的DNA双链断裂细胞模型,筛选得到稳定表达CUL4A/ DDB1的细胞稳定株,为下一步质谱分析CUL4A-DDB1泛素连接酶在DNA损伤修复过程中的新功能打下基础.     

烧伤后大鼠骨骼肌组织泛素及泛素化蛋白表达的变化研究

为研究烧伤大鼠骼肌组织泛素（ubiquitin)及泛素化蛋白表达的变化规律，探讨烧伤后骨骼肌蛋白降解的分子机制，采用大鼠30％Ⅲ度烫伤模型，分为伤后2、6、12和24h组，每组设正常对照组，于伤后不同时间点分别测定大鼠骨骼肌孵育液中伸趾长肌蛋白降解率以及伸趾长肌组织中泛素及泛素化蛋白的表达变化。结果发现，大鼠烧伤后伸趾长肌蛋白降解率增强，尤其是肌纤维蛋白降解增强明显（P＜0．01），伤后12h增加185％，24h增加153％；伸趾长肌泛素及泛素化蛋白的表达在烧伤后各时相点均显著增加（P＜0.01)，尤以12h和24h为明显，表达增加的泛素化蛋白主要为高分子量蛋白。提示烧伤后大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢与泛素及泛素化蛋白的高表达关系密切。     

TAR DNA结合蛋白43与泛素体外共相分离机制初步研究

目的 探究TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)与泛素共相分离的动态变化特征及机制。方法 构建TDP-43全长及各结构域原核表达质粒,纯化泛素和TDP-43全长及各结构域截短体蛋白,构建泛素和TDP-43体外的相分离体系,利用荧光显微镜观测通过液-液相分离形成的液滴的动态特征。将泛素和TDP-43真核表达质粒转染入HEK293T细胞内表达,利用荧光显微镜观察TDP-43与泛素形成聚集体并通过pull-down实验检测TDP-43泛素化修饰。结果 成功纯化得到泛素和TDP-43全长及各结构域截短体蛋白。体外相分离体系中发现TDP-43全长和CTD截短体蛋白能够与泛素发生共相分离,且延长孵育时间液滴最终变成流动性较差的聚集体。在细胞内共转染泛素和TDP-43质粒,二者形成不可溶的聚集体,应激条件下TDP-43能够被泛素化修饰。结论 TDP-43能够与泛素蛋白发生共相分离,主要通过TDP-43的CTD结构域与泛素间的多价相互作用驱动,且该凝聚体液滴易形成流动性差的聚集体。在应激条件下,当细胞内蛋白稳态失衡时,TDP-43与泛素被募集到一起形成聚集体且聚集体内的TDP-43会被泛素化修饰。...     

hsa-miR-5688在肝细胞癌中靶途径预测体系的构建与验证

目的 构建并预测在原发性肝细胞癌(肝癌)中hsa-miR-5688的靶途径及调控机制,并通过TCAG数据库和串联质量标签(TMT)标记LC-MS/MS蛋白质测序方法验证其结果,以期构建准确高效的微小RNA(miRNA,miR)靶途径预测方案.方法 通过五大线上数据库筛选hsa-miR-5688靶基因,对细胞定位、分子功能、信号通路、疾病、组织表达和基因互作进行富集分析,构建分析策略,预测其靶途径及调控机制.利用TCAG数据库分析调控途径中靶基因的mRNA表达量、突变频率和生存曲线;基于肝癌复发和预后良好的肝癌组织标本,应用TMT标记蛋白质结合LC-MS/MS方法对靶途径中的互作蛋白进行定量检测,以验证预测体系的正确性.结果 预测获得hsa-miR-5688调控的靶基因,包括信使RNA(mRNA)3031个,环状RNA(circRNA)1511个;代谢通路、细胞定位、分子功能、疾病、组织表达等富集结果经多重分析发现,靶基因RHOBTB1和UBE2W共同参与的泛素化蛋白降解途径是其调控肝癌进程的最关键信号通路.TCAG临床数据分析表明,泛素化途径的靶基因mRNA表达量在肝癌组织中明显高于正常肝组织,且基因突变会明显降低患者生存率.TMT标记蛋白质结合LC-MS/MS分析表明,与RHOBTB1和UBE2W互作的蛋白质泛素化降解相关基因UBA5、NEDD4L、UBE3C和USP14直接参与肝癌复发调控.结论 hsa-miR-5688可通过泛素化蛋白降解途径参与肝癌发生和复发进程,证明通过优化生物信息学构建快速预测miRNA靶途径的体系具有一定的高效性和准确性.     

活性氧与细胞周期调控

细胞周期进程由多种外界因素调控,活性氧可能在细胞周期进程中发挥重要作用.细胞信号转导级联、蛋白泛素化及降解、细胞骨架以及细胞周期调控蛋白等系统都参与活性氧的细胞周期调控作用.深入了解活性氧的细胞周期调控作用对于癌症以及其他疾病治疗有着非常重要的意义.     

泛素连接酶CUL4A-DDB1复合体参与DNA损伤修复的研究进展

泛素化修饰在DNA损伤信号中发挥重要功能,包括细胞周期监控、DNA修复、细胞衰老和程序性死亡的调控。CUL4A-DDB1泛素连接酶通过DCAFs靶向调控特异性的底物,启动DNA切除修复机制对受损DNA进行修复。近期的研究表明CUL4A-DDB1泛素连接酶协助DNA修复因子与受损DNA的识别,来维持基因组的稳定性和正确性。     

蛋白SUMO化修饰与疾病关联性的研究进展

类泛素化修饰蛋白（small ubiquitin-related modifier,SUMO）是一类重要的类泛素蛋白,SUMO化修饰对底物蛋白功能的发挥起着重要的调节作用。SUMO化修饰的异常与人类许多重大疾病密切相关,如肿瘤、神经退行性病变、脑损伤、糖尿病以及家族性扩张型心肌病等。     

SCF泛素化途径对c-Myc蛋白降解的调节作用

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是细胞内降解蛋白质的重要途径，与细胞多种生理功能调节密切相关。本文主要论述了SCF（Skp-cullin-F-boxprotein）泛素化途径及对原癌基因c-myc产物的降解调控作用。     

一次大强度运动对大鼠骨骼肌泛素蛋白酶体途径基因表达及蛋白质降解的影响

目的:观察1次大强度运动后骨骼肌泛素蛋白酶体途径组成成分基因表达的变化,探讨该途径在运动后骨骼肌蛋白质降解中的作用。方法:36只雄性SD大鼠,体重190～220 g,跑台运动适应3天,休息1天,取6只为安静对照,其余大鼠进行1次1小时跑台运动(25 m/min,5%坡度)。运动0.5小时即刻、运动1小时即刻、运动后1小时、运动后2小时、运动后6小时,分别选6只大鼠取腓肠肌,用Real-Time PCR法测定泛素、MuRF1、MAFbx mRNA含量,用Western Blot法检测泛素化蛋白含量,用高效液相色谱法检测肌肉3-MH含量。结果:运动0.5、1小时即刻至运动后6小时,腓肠肌泛素mRNA含量与安静时比较无显著性差异(P>0.05)。1小时运动后1、2和6小时,腓肠肌MAFbx和MuRF1 mRNA含量较安静时显著升高(P<0.01,P<0.05)。1小时运动后6小时,腓肠肌泛素化蛋白含量显著高于安静时(P<0.01)。运动0.5小时、1小时即刻和运动后6小时,腓肠肌3-MH含量显著高于安静(P<0.01)。结论:1次大强度运动后,骨骼肌泛素蛋白酶体途径基因表达升高,骨骼肌收缩蛋白降解增加。     

严重烫伤大鼠骨骼肌26S蛋白酶复合体和19S调节复合体活性的变化

为阐明及防治烧作后负氮平衡提供理论依据，在接近体内环境于体外用免疫沉淀扣除法检测30％体表皮肤全层汤伤大鼠伤后第1、2、3、5、7天内骨骼肌中26S蛋白酶复合体及19S调节复合体活性的变化。结果发现，从烫伤后第2天开始，大鼠骨骼肌中26S蛋白酶复合体及19S调节复合体的蛋白酶活性和ATPase活性均明显增加，提示烧伤可激活26S蛋白酶复合体系统，从而参与骨骼肌蛋白质的降解作用，这可能与烧伤后负氮平衡的发生密切相关。