四环素及其衍生物诱导表达的pTet-On肺癌细胞系A549的建立

目的:构建可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体统A549 pTet-On细胞系。用于F10基因的功能研究。方法:将pTet-On质粒用脂质体介导法转染A549细胞,利用G418的药物选择特性,对转染的A549细胞进行压力筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,单克隆分别扩增后,瞬时转染pTRE-luc(编码荧光素酶蛋白)质粒,Dox诱导表达后,检测荧光素酶活性,逐一筛选四环素调控高表达外源基因的A549 pTet-On细胞株。结果:成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的A549pTet-On细胞株。结论:筛选的A549细胞为F10基因表达能被pTet-on诱导表达系统调控的细胞系,为研究F10基因功能提供了理想的细胞模型。适合在此基础上对F10基因进行深入的研究。     

托吡酯对大鼠星形细胞内谷胱甘肽硫转移酶及多药耐受基因的影响

目的 :探讨托吡酯的药物耐受性及其机制。方法 :不同浓度托吡酯持续作用于培养的新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞 ,对照组不加药。分别在给药后 5 ,10 ,15和 2 0d ,测定细胞内谷胱甘肽硫转移酶 (GST)的活性 ,在加药后 10和 15d用流式细胞术检测多药耐受基因 (MDR1)标志物P 糖蛋白(Pgp)的表达率 ,并与对照组比较。结果 :对照组细胞内GST的活性在各时间点无差异 (P >0 .0 5 )。加托吡酯 5d时 ,4 0 ,80 ,16 0mg·L- 1组GST活性明显升高 ;加药 10d时 ,各浓度组细胞内GST活性均明显升高 ;10d后GST活性变化无显著意义(P >0 .0 5 ) ,细胞内GST活性随托吡酯浓度的增加有上升趋势。各浓度组在 15d以内Pgp的表达率与对照组比较差异无显著意义 (P >0 .0 5 )。结论 :托吡酯可使GST活性升高 ,且与剂量和时间有关 ,提示其可能有代谢性药物耐受性存在 ,托吡酯对MDR1基因表达无影响 ,表明其与其他抗癫痫药能诱导MDR1表达的作用不同。     

枸杞多糖对2型糖尿病大鼠胰腺β细胞PDX-1基因表达的实验研究

目的探讨枸杞多糖对2型糖尿病大鼠β细胞分泌功能及PDX-1基因mRNA表达的影响。方法用高糖饲喂并结合链脲佐菌素诱导制备2型糖尿病大鼠模型,分组灌胃给予不同浓度的枸杞多糖及对照药物,50只实验动物随机分为5组:对照组、模型组、模型+30mg/kgLBP组、模型+60mg/kgLBP组、模型+90mg/kgLBP组。连续8周后检测空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清胰岛素,处死大鼠取胰腺组织,RT-PCR检测β细胞内PDX-l及胰岛素mRNA的表达水平。结果 2型糖尿病大鼠胰腺β细胞PDX-l及胰岛素mRNA的表达水平显著下降(P0.01);60mg/kg和90mg/kgLBP组能显著上调2型糖尿病大鼠胰腺β细胞PDX-l与胰岛素mRNA表达水平(P0.05)。结论 LBP可以通过上调PDX-l和胰岛素mRNA表达,改善2型糖尿病大鼠β细胞胰岛素合成和分泌功能的损伤。     

强力霉素对胃癌细胞增殖及Notch1、 MMP-9表达的影响

【摘要】目的 研究强力霉素对胃癌细胞BGC-823细胞的增殖及 Notch1、MMP-9 蛋白表达的影响,为胃癌的治疗提供新的抗肿瘤药物。方法 分别以 0、5、10、20、40 μg/mL 终浓度的强力霉素作用于人胃癌细胞系 BGC-823,运用 MTT 法检测细胞增殖程度;流式细胞仪检测细胞周期分布的影响; Western Blot 检测 Notch1、MMP-9 蛋白水平的表达。结果 强力霉素能够抑制人胃癌细胞BGC-823细胞的增殖,且与药物的剂量及作用时间呈正相关（P＜0.01）;强力霉素能够改变胃癌细胞BGC-823周期的分布,随着浓度的增加,S 期所占比例降低（P＜0.01）;并且随着浓度的增加,Notch1 的表达增强,MMP-9 的表达降低（P＜0.01）。结论 强力霉素能够抑制胃癌细胞BGC-823的增殖,Notch1上调为可能的机制之一     

miR-7和miR-153抑制α-syn表达在百草枯诱导多巴胺能神经元损伤中的作用机制

目的探讨miRNA-7和miRNA-153在百草枯(PQ)诱导多巴胺能神经元损伤中抑制α-syn表达的作用机制。方法运用TargetScan和HMDD等基因预测软件预测miR-7和miR-153与α-synuclein蛋白编码基因(SNCA)结合位点及与帕金森病相关性。选择高表达内源性α-syn的HEK293T细胞作为转染细胞株,采用化学合成miRNAs模拟物和抑制剂转染HEK293T细胞调控其miR-7和miR-153表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞α-syn基因与蛋白表达水平,观察miR-7和miR-153与内源性α-syn基因表达的关系;为了进一步研究在环境化学物PQ诱导下miR-7和miR-153对α-syn基因的调控作用,以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)作为多巴胺能神经元体外模型,不同浓度PQ(0、25、50、100、200、400和800μmol/L)处理细胞24 h, 100μmol/L PQ处理细胞不同时间(0、12、24、36、48、60和72 h),CCK8法检测细胞增殖活性;RT-qPCR检测miR-7、miR-153表达,Western blot检测α-syn蛋白表达水平;对多巴胺能神经元分别转染miRNA模拟物和miRNA抑制剂后再进行PQ诱导24 h, Western blot和RT-qPCR检测α-syn蛋白及基因表达水平。结果生物信息学分析显示,α-syn编码基因(SNCA) 3′-UTR有两个片段能够与miR-7(序列120～127)和miR-153(序列459～465)结合;上调HEK293T细胞miR-7和miR-153表达后,α-syn基因和蛋白表达水平均明显下降,尤其在100 nmol/L浓度下降明显(P0.05);相反,抑制miRNA表达后α-syn基因和蛋白表达水平升高(P0.05),说明miR-7和miR-153能够靶向下调α-syn基因进而抑制α-syn蛋白表达。进一步使用外源化学物PQ处理多巴胺能神经元,染毒组细胞增殖活性随剂量和时间的增加而下降(P0.05);细胞内α-syn蛋白表达水平升高(P0.05);而miR-7和miR-153表达水平明显降低(P0.05);向细胞转染miRNA模拟物以上调miRNA表达后,α-syn mRNA和蛋白表达均被抑制(P0.05),而转染miRNA抑制剂抑制miRNA表达,α-syn mRNA及蛋白表达增加(P0.05)。结论 MiR-7、miR-153在PQ诱导多巴胺能神经元损伤中抑制了α-syn基因及蛋白表达。     

克拉霉素抑制气道黏液高分泌细胞内机制的研究

目的 研究克拉霉素(CLA)抑制气道黏液高分泌的细胞内分子机制.方法 运用中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)刺激人类支气管上皮细胞株HBE16构建气道黏液高分泌模型,予以CLA和信号末端调节激酶1/2(ERK1/2)特异性抑制剂U0126进行干预,采用RT-PCR检测细胞内黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平,ELISA法检测细胞上清液中MUC5AC蛋白含量,Westernblotting检测细胞内磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化c-Jun N端激酶(p.ⅢK)、磷酸化P38(p-P38)的含量.结果 克拉霉素和U0126均能降低气道黏液高分泌模型中MUC5AC基因转录和蛋白表达水平,并且使p-ERK表达水平下降,但对p-EGFR、p-JNK、p-P38的表达无明显作用.结论 克拉霉素能抑制细胞内信号通路分子ERK1/2磷酸化水平,从而减少了气道上皮细胞产生MUC5AC,由此发挥抑制气道黏液高分泌的作用.     

二甲胺四环素增强博安霉素的抗肿瘤转移作用

博安霉素对小鼠Lewis肺癌的肺转移有显著抑制作用;用等毒性剂量进行比较,博安霉素的肺转移抑制率高于丝裂霉素。单独给博安霉素(5mg·kg^-1)对肺转移抑制率为67%,对其中大转移瘤结(直径>2mm)的抑制率为85%;博安霉素与二甲胺四环素(5mg·kg^-1)联合使用时,对肺转移瘤以及时大转移瘤结的抑制率分别为88%和100%,两药相互作用指数CDI<0.5(P<0.01),表明二甲胺四环素能明显增强博安霉素的抗转移作用。酶联免疫测定证明,二甲胺四环素能降低肺巨细胞癌PG细胞IV型胶原酶的表达,Fura-2/AM荧光法测定,二甲胺四环素能显著降低PG细胞内游离Ca²⁺的水平。本研究结果提示博安霉素与二甲胺四环索联合用药可能有利于控制肿瘤转移,二甲胺四环素的增效机制可能与抑制IV型胶原酶的表达、干扰肿瘤侵袭与转移的过程有关。     

一种新发现的强力霉素代谢产物的定量检测:N-去甲强力霉素的体外形成及小鼠体内的分布

作者用HPLC测定了小鼠组织和体液中的强力霉素及其代谢产物:N-去甲强力霉素(下简称N-D)。将雌性小鼠分为对照组和诱导组,后者腹腔注射苯巴比妥35mg/kg,以诱导药物代谢酶,每天二次,给药三天;对照组小鼠给予等量生理盐水。预处理后,二组小鼠均静脉注射强力霉素50mg/kg。在给药后不同间隔内(2～20h)处死小鼠,取组织和体液样品。另用二组小鼠的肝脏微粒体研究体外强力霉素去甲基化作用,并借乙基吗啡去甲基化作用来鉴定此体外试验的有效性。     

胰高血糖素样肽-1对胰岛素抵抗肌细胞脂代谢相关基因表达的干预作用

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,Glp-1)对胰岛素抵抗肌细胞模型的胰岛素敏感性和脂类代谢相关基因的影响。方法:分化成熟的肌小管细胞经软脂酸(palmitate,PA)诱导,建立胰岛素抵抗肌细胞模型。在此基础上,用药物Glp-1干预后,检测胰岛素抵抗指标的变化,并用real time PCR的方法检测脂类代谢相关基因的转录水平。结果:浓度为0.25 mmol.L-1的PA孵育成肌细胞C2C12 24 h后,细胞能被诱导成胰岛素抵抗状态。Glp-1干预后,葡萄糖消耗量和摄取率显著升高,细胞内脂类堆积明显减少。脂类合成相关基因Fas的mRNA水平在胰岛素抵抗细胞中显著上升,经Glp-1干预后表达量显著下降,而脂肪酸氧化分解的多个关键基因在胰岛素抵抗及Glp-1处理组中并没有呈现出一致的变化。结论:PA能够诱导分化成熟的C2C12细胞为胰岛素抵抗肌细胞。Glp-1药物能够增加胰岛素抵抗肌细胞的胰岛素敏感性,并能够通过调节脂类代谢基因的表达而改善细胞的脂类沉积状态。     

AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1( )AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1( ),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1( )AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

Effect of cobra venom (Naja haje) on insulin release by rat pancreas in vitro

Additions of cobra venom at 10, 20 and 30 μg per ml to incubation media of rat pancreas caused no significant effect on insulin release. Additions of the venom at a concentration of 60 μg per ml caused a significant inhibition of glucose induced insulin secretion at low (60 mg per 100 ml) and high (300 mg per 100 ml) glucose concentrations. The possibilities of local release of adrenergic transmitter, impaired glucose metabolism by the beta cells and diminished intracellular levels of cyclic AMP in the beta cells, by venom are discussed.     

肿瘤抗原基因MAGE-A9的克隆及原核表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9cDNA,构建原核表达载体,表达并纯化MAGE-A9蛋白。方法从人肝癌组织提取总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株。以L-Arabi-nose进行诱导表达,并纯化。结果获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子质量为35 000。结论成功地构建了pBAD/gⅢ-MAGE-A9原核表达质粒,获得了MAGE-A9蛋白,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

LOX-1对氧化低密度脂蛋白所诱导的PAI-1基因表达的影响

目的探讨血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体(LOX)-1对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所诱导1型纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响。方法不同浓度ox-LDL培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用倒置显微镜观察内皮细胞形态变化,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定LOX-1、PAI-1mRNA表达,Westernblot、酶联免疫吸附试验(ELISA)分别测定LOX-1、PAI-1蛋白的表达。结果不同浓度ox-LDL组,LOX-1和PAI-1mRNA和蛋白的表达明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.01);用250μg/mLPoly(Ⅰ)与HUVECs预先作用2h后,再加入50μg/ml的ox-LDL培养24h,与未加Poly(Ⅰ)相比,LOX-1和PAI-1mRNA和蛋白的表达明显减少(P<0.05)。结论ox-LDL可以调节培养的脐静脉内皮细胞LOX-1和PAI-1表达;LOX-1作为ox-LDL特异性受体,介导了ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞表达LOX-1。同时该实验提示了ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞表达PAI-1是通过LOX-1介导的。     

Human proinsulin gene-transfected Chinese hamster ovary cells secrete immunoreactive insulin

BACKGROUND: Considering the difficulties in pancreas transplantation, the development of an artificial pancreas can be one of the new approaches. The present study was designed to assess whether or not Chinese hamster ovary (CHO) cells, which were transfected with the human proinsulin (hPI) gene, secrete immunoreactive insulin (IRI) and respond to glucose loading. MATERIALS AND METHODS: A complementary DNA encoding hPI was obtained by polymerase chain reaction amplification from human pancreatic tissue and was inserted into the plasmid pcDNA I/NEO to construct an expression vector for the hPI gene. CHO cells were transfected with hPI gene using lipofectin, and the hPI gene-expressing clones (CHO/I) were selected. RESULTS: Five clones of CHO/I cells, releasing IRI into the culture supernatant, were separated. Immunohistochemistry with a monoclonal antibody demonstrated the IRI in the cytoplasm of CHO/I cells, and transmission electron microscopic examination demonstrated the prominently developed mitochondria, but no secretion granules. ELISA assay demonstrated the secretion of IRI into the culture supernatant of CHO/I, but CHO/I cells did not respond to the glucose loading. When CHO/I cells were transplanted subcutaneously into the back of nude mice, the growing tumors secreted IRI. CONCLUSIONS: These results demonstrate that the hPI gene can be transfected into mammalian cells and function in vivo, and suggest that this kind of gene technology may be applicable in the development of an artificial pancreas.     

新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。     

ZNF24基因过表达慢病毒载体的构建及其在人结直肠癌HCT116细胞中的表达

目的 通过构建ZNF24基因过表达慢病毒载体,建立ZNF24基因过表达的人结直肠癌HCT116细胞株,为开展后续研究提供物质基础。方法 通过PCR扩增ZNF24基因序列片段和3FLAG标签序列片段,并将两产物通过同源重组克隆至慢病毒载体pMT406中,构建成重组表达ZNF24慢病毒质粒pMT-ZNF24。将重组质粒pMT-ZNF24与辅助包装载体质粒p CMV-dR8.9和pCMV-VSV-G一起共转染293T细胞并收集慢病毒。应用孔稀释法检测病毒滴度,用qRT-PCR和蛋白印迹法检测慢病毒转染HCT116细胞后ZNF24的表达水平。结果 成功构建了重组载体pMT-ZNF24,并获得相应的病毒,病毒滴度为3.25×10⁹ TU/ml。转染重组ZNF24慢病毒的HCT116细胞中ZNF24表达水平显著高于空白组和阴性对照组细胞。结论 构建了ZNF24基因过表达慢病毒载体,并获得相应的病毒和稳定表达ZNF24的HCT116细胞株。     

利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-1的研究

目的利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子 1(rhIGF 1)。方法将 15kD人IGF 1(hIGF 1)前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)转移载体pBak PAK8中 ,经与野生型病毒DNA共转染家蚕细胞后 ,通过体内同源重组的方式获得重组病毒BmNPV/IGF 1。以Bm NPV/IGF 1感染 5龄家蚕幼虫 ,分别在感染后 2 4、48、72、96、10 8、12 0h提取家蚕血淋巴液 ,以ELISA法测定不同时象家蚕血中IGF 1浓度 ,采用Western blot分析鉴定IGF 1免疫学活性 ,MTT法观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。结果ELISA测定显示 ,BmNPV/IGF 1感染家蚕幼虫后 ,72h起蚕血中IGF 1浓度随感染时间延长而逐渐增高 (19.0 9～ 2 3.36 μg/ml) ,12 0hIGF 1含量达到最高值 (2 3 .36 μg/ml) ,Western blot分析发现表达产物在蚕体内被加工成 7.5kD成熟hIGF 1,并对NIH3T3细胞具有良好促增殖效应 ,其促细胞增殖能力明显优于来源于E .coli的IGF 1标准品。结论具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF 1能够在家蚕幼虫虫体中获得高效表达     

RANTES对肥大细胞Toll样受体4表达的作用

目的探讨趋化因子T细胞激活分泌调节因子(RANTES)对肥大细胞Toll样受体4(TLR4)表达的调节作用。方法将小鼠肥大细胞P815分为:RANTES 0.1、1.0、10、100ng/ml处理组(分别为A1、A2、A3、A4组)、RANTES 100ng/ml+RANTES阻断抗体10、30μg/ml组(分别为B1、B2组)以及空白对照组(C组)。作用2、6、16h后,采用流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR检测肥大细胞上TLR4的表达情况。结果与C组相比,RANTES呈剂量依赖性地上调P815细胞中TLR4mRNA和蛋白表达(P<0.05),而B1、B2组能明显抑制该上调过程(P<0.05)。结论 RANTES上调P815细胞中TLR4的表达,从而加重过敏反应。