激光扫描共聚焦显微技术及在药学上的应用

激光扫描共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的医药学图像分析仪器,现已成为细胞生物学、生理学、病理学及药学等研究领域中很重要的技术、其性能是普通光学显微镜的一个飞跃,是电子显微镜的一个补充。本文拟以激光扫描共聚焦显微镜的原理、药学上的应用及其前景作一个简单介绍。     

激光扫描共聚焦显微镜检测肿瘤细胞药敏的临床意义

激光扫描共聚焦显微镜(laserscanning confocal microscope)是近代生物医学图像仪器的重要发展之一,已广泛应用于细胞生物学、生理学及病理学等许多领域。使用Ca2 高度特异性荧光指示剂Flou-3/AM[1],激光扫描共聚焦显微镜可以检测细胞内Ca2 浓度的变化[2]。化疗药物的抗肿瘤效果     

共聚焦超分辨率成像与SIM超分辨率成像在蒿草生物组织样本荧光成像中的使用价值分析

目的 研究分析共聚焦超分辨率成像与SIM超分辨率成像在蒿草生物组织样本荧光成像中的使用价值。方法 使用激光扫描共聚焦显微镜对蒿草生物组织样本进行荧光成像和使用结构光照明显微镜对蒿草生物组织样本进行SIM超分辨率荧光成像。实验分为三组。(1)使用激光扫描共聚焦显微镜对蒿草组织样本共聚焦普通成像;(2)使用激光扫描共聚焦显微镜的超分辨率成像模块对蒿草组织样本超分辨率成像;(3)使用结构光照明显微镜对蒿草组织样本SIM超分辨率成像。结果 激光扫描共聚焦显微镜不仅可获取蒿草组织样本的不同倍数共聚焦普通图像,而且可获取蒿草组织样本的共聚焦超分辨率图像;结构光照明显微镜可获取蒿草组织样本的SIM超分辨率荧光图像。结论 激光扫描共聚焦显微镜和结构光照明显微镜均可对生物组织样本进行超分辨率成像。共聚焦超分辨率成像图像清晰度较高,色彩对比度明显,而SIM超分辨率成像具有显示组织样本局部的超微结构细节更加突出的特点。     

激光扫描共聚焦显微技术在医药研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是在显微镜基础上配置激光光源,扫描装置,共轭聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。1971年美国Davidovits和Egger发明了以激光为光源的透镜扫描系统,1978年Sheppard等推出了载物台扫描装置。1979年有了样品扫描装置,1980年Koestert等介绍了单镜扫     

共聚焦激光扫描显微镜在反向银屑病诊断中的应用研究

目的探讨共聚焦激光扫描显微镜在反向银屑病诊断和鉴别诊断中的应用价值。方法选取临床疑诊反向银屑病的患者20例,比较共聚焦激光扫描显微镜扫描检查和常规组织病理检查的结果。结果20例患者共聚焦激光扫描和组织病理检查结果经统计学分析,无显著性差异。结论共聚焦激光扫描为反向银屑病提供了有价值的、无创的、新的诊断方法。     

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

比较布比卡因和罗哌卡因对大鼠心室肌细胞Ca2+移动的影响

目的:应用激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度的布比卡因和罗哌卡因对大鼠心室肌细胞Ca2 移动的影响,比较它们的心肌毒性。方法:原代培养新生SD大鼠的心室肌细胞,应用激光扫描共聚焦显微镜观察心室肌细胞内钙荧光强度的变化,比较不同浓度的布比卡因和罗哌卡因对KCl诱导的荧光强度峰值的影响。结果:10μmol/L时两种局麻药对KCl诱导的大鼠心室肌细胞内钙荧光强度的变化无显著影响;50μmol/L和100μmol/L时两种局麻药明显抑制细胞内钙荧光强度的变化;相同浓度的布比卡因抑制作用大于罗哌卡因。结论:同浓度布比卡因对心室肌细胞Ca2 移动的抑制作用大于罗哌卡因,表明布比卡因心肌毒性大于罗哌卡因。     

共聚焦激光扫描显微镜在药剂学中的应用

共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)是近年来一项新的、快速发展的、对样品无损害的成像技术.文章介绍了CLSM的基本原理,并参阅具有代表性的最新文献,分析和讨论了CLSM在药剂学研究领域的应用.随着CLSM技术的进一步发展和完善,它必在药学研究各领域发挥更大作用.     

灵芝多糖对小鼠T细胞胞浆游离Ca2+浓度和胞内pH的影响

目的通过考察灵芝多糖(GLP)对免疫细胞信号转导过程的影响,探讨GLP免疫调节作用机制。方法采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术,动态监测GLP均一体组分GLB7对小鼠T细胞胞浆游离Ca     

3种抗真菌生药活性成分对两种真菌细胞遗传物质的影响

目的　研究抗真菌生药活性成分对真菌细胞遗传物质的影响,以期发现其抗真菌的作用机理。方法　把对照组及用药组真菌细胞进行激光扫描共聚焦显微镜观察并作细胞扫描图像分析,从而定量描述细胞形状、面积和DNA,RNA含量。结果　用药组细胞形态及DNA,RNA含量发生不同变化。结论　澳洲茄胺、紫檀　和白鲜碱直接或间接影响了真菌细胞遗传物质的正常合成以至不能完成正常细胞周期,从而抑制真菌生长甚至导致死亡。     

共聚焦激光扫描显微镜诊断银屑病的研究

目的:论证共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)在银屑病诊断中的作用.方法:对临床确诊为银屑病的44例患者运用CLSM观察银屑病患者皮肤图像,与其病理检查结果进行对比分析.结果:两种检查方法对于角化不全、颗粒层减少或消失、表皮棘层肥厚及表皮突下延和中性粒细胞在表皮中的浸润的检出率比较,差异无统计学意义;真皮乳头毛细血管迂曲扩张达到顶部的比较,CLSM检出率明显高于病理检查,而真皮浅层血管周围单一核细胞浸润的比较,病理检查检出率高于CLSM.结论:CLSM发现银屑病特征性皮肤结构改变的敏感性略优于病理学检查.     

灵芝多糖体外对小鼠腹腔巨噬细胞pH的影响

目的　探讨灵芝多糖（ＧＬＰ）对免疫细胞信号转导过程的影响。方法　采用激光扫描共聚焦显微镜技术,动态监测ＧＬＰ均一体组分ＧＬＢ７对小鼠腹腔巨噬细胞（ＭΦ）胞内ｐＨ（［ｐＨ］ｉ）的影响。结果　ＧＬＢ７引起小鼠腹腔ＭΦ［ｐＨ］ｉ明显升高,［ｐＨ］ｉ的升高与Ｎａ＋／Ｈ＋交换系统及细胞［Ｃａ２＋］ｉ有关。结论　ＭΦ是灵芝多糖作用的靶细胞,ＧＬＢ７引起ＭΦ［ｐＨ］ｉ快速升高的现象,是灵芝多糖产生作用的重要途径。     

Ki-67和PCNA在乳腺癌中的表达

目的:研究Ki-67与PCNA两种增殖抗原在乳腺癌组织中的原位表达特点及二者的差异性问题。方法:采用间接免疫荧光双标法对60例乳腺癌组织切片进行Ki-67及PCNA染色。运用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM),分析细胞核的荧光阳性面积,并对二者进行相关性分析。结果:PCNA的核阳性面积明显大于Ki-67。二者的阳性面积呈正相关。结论:在乳腺癌组织中,PCNA抗原表达较强,几乎涵盖了所有Ki-67的增殖信息,二者对增殖情况的反映各具特点。     

布比卡因对大鼠心室肌细胞内钙的影响

目的：运用激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度的布比卡因对KCI诱导的大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度（[Ca^2＋]。）的影响，进而探讨布比卡因心肌抑制作用的可能机制。方法：培养新生SD大鼠心室肌细胞，将培养的心室肌细胞随机分为4组．分别为对照组（C组）、10μmol／L布比卡因组（B2组）、50μmol／L布比卡因组（岛组）、100μmol／L布比卡因组（取组）。各组细胞均用钙荧光指示剂Fluo-3／AM染色，运用激光扫描共聚焦显微镜动态观察单个心室肌细胞内钙荧光强度（fluorescent intensity．FI）的变化。结果：与对照组比较10μmol／L的布比卡因对KCl诱导的大鼠心室肌细胞内钙FI变化无明显影响（P〉0.05），50μmol／L和100μmol／L的布比卡因则明显抑制KCl诱导的钙离子跨膜内流（P〈0．05）；抑制程度B2组〉B2组（P〈0．05）。结论：低浓度的布比卡因对KCl诱导的大鼠心室肌细胞内[Ca^2＋]i的变化无明显影响，高浓度则明显抑制钙离子跨膜内流。布比卡因呈浓度依赖性抑制兴奋收缩耦联时心室肌细胞内游离钙离子内流，可能是其心肌抑制作用的原因之一。     

玉米赤霉烯酮对细胞间隙连接通讯的影响

目的 了解真菌性雌激素玉米赤霉烯酮(ZEA)对细胞间隙连接通讯(GJIC)的影响。方法 用荧光漂白后恢复(fluorescence redistribution after photobleaching，FRAP)技术，在激光扫描共聚焦显微镜下观察ZEA对HaCaT细胞GJIC功能的影响。结果 ZEA在0．1μmol/L对HaCaT细胞的GJIC没有明显影响，但在I—100μmol/L浓度下都有明显的抑制作用。ZEA不能有效地拮抗TPA引起的GJIC抑制。结论 ZEA在1μmol/L以上就能抑制GJIC功能，提示它在一定条件下可能有促癌作用。     

激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜的形成

目的采用激光共聚焦显微镜技术观察铜绿假单胞菌形成生物膜,进一步揭示了铜绿假单胞菌生物膜形成过程。方法使用盖玻片生物膜培养法,培养铜绿假单胞菌的生物膜,在培养2、4、8、12、16、24、48和72h后取出盖玻片,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的刀豆蛋白A(FITC-ConA)和碘化吡啶(PI)双重免疫荧光技术染色,用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察铜绿假单胞菌生物膜形成过程与特点。结果获得生物膜形成过程不同时间点的CLSM图像,观察到铜绿假单胞菌一般在24h后开始逐渐形成生物膜,在72h形成稳定的生物膜。结论双重免疫荧光染色技术和CLSM是观察细菌生物膜形成过程的有效手段。     

荞麦花叶总黄酮的舒张血管作用及其机制

目的探讨荞麦花叶总黄酮(TFBFL)对大鼠离体胸主动脉的舒张作用与机制。方法采用离体血管环灌流装置,经生物信号采集与分析系统测定血管环张力的变化;激光扫描共聚焦显微镜技术检测血管平滑肌细胞内钙浓度。结果在苯肾上腺素(phenylephrine,PE)10-6mmol.L-1或KCl60 mmol.L-1预收缩的保留内皮和去除内皮的血管环中,TFBFL均能够浓度依赖性的引起血管舒张;相对于去除内皮的血管环,TFBFL对保留内皮的血管环的舒张作用更明显。保留内皮的血管环用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100mmol.L-1)预孵后,TFBFL诱导的血管舒张作用明显减弱。在无钙灌流液中,用KCl 60 mmol.L-1去极化去除内皮的血管环后,逐渐加入Ca2+,使血管环呈浓度依赖性收缩;TFBFL(0.8 mg.L-1)孵育10 min后可使CaCl2的量效曲线向下移位且可使PE在无钙灌流液中诱导的血管环最大收缩幅度明显降低。激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内钙的结果表明,TFBFL浓度依赖性(0.4、0.8 mg.L-1)的抑制了静息状态平滑肌细胞质内钙浓度的升高。结论 TFBFL能够浓度依赖性舒张大鼠胸主动脉,其作用机制可能是降低细胞内游离Ca2+浓度;对于保留内皮的血管环,TFBFL也作用于血管内皮细胞,促进一氧化氮的释放,引起血管舒张。     

三氧化二砷抑制乳腺癌MCF-7细胞作用机制的研究

目的 探讨三氧化二砷抑制乳腺癌MCF-7细胞的作用机制.方法 时滞显微摄影技术用于检测细胞容量;激光扫描共聚焦显微镜观察细胞钙离子的变化.结果 三氧化二砷作用后的MCF-7细胞出现凋亡性容量下降,并且细胞内钙明显升高.结论 三氧化二砷诱导MCF-7细胞凋亡与凋亡性容量下降和钙超载有关.     

重组人食管癌相关基因4蛋白的体外抑癌功能研究

目的探讨人食管癌相关基因4(esophageal cancer related gene4,ECRG4)蛋白的亚细胞定位和重组ECRG4蛋白的体外抑癌功能。方法用激光扫描共聚焦显微镜成像法和Western blot方法检测ECRG4蛋白的定位;用MTT方法检测纯化的重组ECRG4蛋白的体外抑癌功能。结果激光扫描共聚焦显微镜成像显示,内源性和外源性ECRG4蛋白主要定位在细胞质。Western blot方法在细胞无血清培养液中检测到ECRG4蛋白存在,提示ECRG4蛋白是分泌蛋白。纯化的重组ECRG4蛋白可以体外抑制EC9706细胞的增殖,抑制率随着ECRG4蛋白浓度增加而升高,成剂量-效应关系(P<0.05)。结论重组人ECRG4蛋白体外抑制肿瘤细胞增殖,可以作为ESCC的潜在治疗药物。     

成年大鼠心肌细胞高效激光共聚焦显微镜钙成像方法

目的建立高效易行的测定心肌细胞钙成像方法。方法Langendorff灌流获取成年大鼠心室肌细胞。大鼠心肌细胞经Fluo-4染色后分别加入玻璃底的6孔培养板中,连接Ion C-Pace EP刺激器,于激光共聚焦显微镜下测定胞内钙离子浓度的动态变化。结果约80％的细胞跟随所设频率规律的收缩。激光共聚焦显微镜记录到与刺激器频率相同的有规则的细胞钙瞬变。加入咖啡因后钙释放增加,提示此为钙库的钙释放。结论利用新型的刺激装置,结合激光共聚焦显微技术,我们成功地获得了高效易行的成年大鼠心肌细胞Ca^＋成像方法。此法也可用于其他实验动物心肌细胞,易于记录细胞内钙离子浓度的动态变化。