钩藤提取物抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管成纤维细胞增殖及胶原合成的研究

目的探讨钩藤碱和异钩藤碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管成纤维细胞(VAF)增殖及胶原沉积的抑制效应及相关机制。方法建立AngⅡ诱导VAF增殖模型,通过四甲基偶氮唑盐比色法、扫描电镜技术、流式细胞术、天狼猩红染色法和逆转录聚合酶链反应等观察钩藤碱和异钩藤碱对其增殖活性、细胞形态、细胞周期、细胞凋亡率、细胞c-myc蛋白表达、细胞培养液中羟脯氨酸含量、细胞间胶原蛋白含量、细胞ColⅠmRNA和ColⅢmRNA的影响。结果AngⅡ刺激VAF增殖,钩藤碱和异钩藤碱抑制AngⅡ诱导VAF增殖;在钩藤碱和异钩藤碱作用下VAF处于G0/G1期的细胞数增多、S期的细胞数减少、细胞凋亡率增加、细胞c-myc蛋白表达降低、细胞培养液中羟脯氨酸含量降低、细胞间胶原表达降低、细胞ColⅠmRNA和ColⅢmRNA转录也降低。结论钩藤碱和异钩藤碱对AngⅡ诱导VAF增殖和胶原沉积有抑制效应,部分机制与其阻滞VAF G0/G1期向S期转化、诱导细胞凋亡、下调细胞c-myc蛋白表达和细胞ColⅠmRNA和ColⅢmRNA转录有关。     

异钩藤碱对缸管平滑肌细胞增殖的影响

目的：研究异钩藤碱对AngⅡ诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响，并进一步观察其对细胞增殖周期，原癌基因c-fos、骨桥蛋白（OPN）以及增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA表达的作用，旨在探讨异钩藤碱作用的分子机制。方法：采用组织块贴壁法培养Wistar大鼠胸主动脉VSMC，利用细胞计数和MTT比色法检测不同浓度异钩藤碱（10^-7、10^-6、10^-5M）和厄贝沙坦（10^-5M）对AngⅡ／（10^-6M）诱导大鼠VSMC增殖的影响；收集细胞培养上清液测定药物对一氧化氮（NO）含量及一氧化氮合酶（NOS）活性的影响；通过流式细胞仪分析药物刘细胞增殖周期的影响；实时荧光定量PCR检测VSMC中c-fos、OPN、PCNAmRNA表达水平。结果：异钩藤碱和厄贝沙均明显抑制AngⅡ诱导的大鼠VSMC增殖，阻滞细胞由GO／GI期向S期转化，升高上清液中NO含量和NOS活性，随着异钩藤碱浓度的增加，c—fos、OPN、PCNAmRNA表达明显减少。     

钩藤生物碱对自发性高血压大鼠胸主动脉平滑肌细胞凋亡和增殖的影响

目的研究钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱对SHR胸主动脉平滑肌细胞凋亡和增殖的影响。方法分别给予SHR钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱,并以Wistar大鼠作为正常对照。用流式细胞仪检测胸主动脉平滑肌细胞凋亡,用免疫组化法检测胸主动脉Bcl-2、Bax、c-myc、c-fos蛋白表达,采用原位杂交法检测胸主动脉平滑肌细胞PDGF mRNA及凋亡平滑肌细胞mRNA的表达。结果钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱均能促进SHR胸主动脉平滑肌细胞凋亡,增强Bax蛋白及凋亡平滑肌细胞mRNA表达,抑制c-fos蛋白、c-myc蛋白和PDGF-B mRNA表达;其中异钩藤碱能抑制胸主动脉Bcl-2表达。结论钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱可能通过调节原癌基因Bcl-2和Bax蛋白表达,促进自发性高血压大鼠动脉平滑肌细胞凋亡,并能通过抑制c-fos蛋白、c-myc蛋白和PDGF-B mRNA表达途径抑制自发性高血压大鼠胸主动脉细胞增殖,从而改善胸主动脉壁重塑。     

厄贝沙坦抑制大鼠平滑肌细胞AT1R及其下游信号通路

目的本研究目的是利用厄贝沙坦、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预平滑肌细胞,阐明血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)对血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)表达及其下游信号通路的影响。方法利用Western Blot技术,研究厄贝沙坦、血管紧张素Ⅱ干预平滑肌细胞后对细胞AT1受体蛋白表达及其下游信号通路-细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和信号转导子和转录激活子3(STAT3)蛋白磷酸化水平的影响。结果研究发现厄贝沙坦能显著地抑制AngⅡ诱导的AT1受体蛋白表达(0.208±0.022 vs 0.997±0.131,P<0.01)及下游信号通路中的ERK1/2蛋白磷酸化(0.055±0.007 vs 0.103±0.020,P<0.01)、STAT3蛋白磷酸化(0.162±0.010 vs 0.758±0.054,P<0.01)。结论这些研究结果表明厄贝沙坦抑制AT1R和下游的ERK1/2及STAT3信号通路,从而抑制AngⅡ诱导的平滑肌细胞增殖等,发挥控制血压、防治心脑血管疾病作用。     

小檗碱对血管紧张素II诱导豚鼠结肠平滑肌细胞增殖的影响

目的观察小檗碱对血管紧张素II(AngII)诱导的培养豚鼠结肠平滑肌细胞(SMC)增殖的影响。方法组织贴块法培养的豚鼠结肠平滑肌细胞随机分成7组:对照组,模型组,小檗碱组(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L),硝苯地平组和溶剂组。分别测定MTT(四甲基偶氮唑盐微量酶)吸收数值和细胞周期中各期细胞构成比。结果AngⅡ(0.1μmol/L)作用24h能使MTT吸收数值明显增加,并使SMC的G0/G1期细胞减少,细胞增殖指数增大。与AngⅡ组相比,AngⅡ加小檗碱(10μmol/L)组,AngⅡ加硝苯地平(10μmol/L),活细胞数减少,G0/G1期的细胞构成比增加,细胞增殖指数减少。结论AngII对SMC有促增殖作用,能被小檗碱所拮抗。     

非水毛细管电泳法测定钩藤中的钩藤碱和异钩藤碱

目的 建市同时测定钩藤中钩藤碱、异钩藤碱含量的方法.方法 采用非水毛细管电泳法,运行缓冲液为0.05 mol·L~(-1)的醋酸铵甲醇溶液(冰醋酸凋pH6.4),操作电压25 kV,温度为20℃,检测波长为239 nm.结果 钩藤碱0.014～0.570mg·mL~(-1)与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9997),加样同收率为98.8%,RSD=2.34%;异钩藤碱0.008～0.194 mg·mL~(-1)与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9996),加样回收率为96.3%,RSD=3.06%.钩藤碱及异钩藤碱可良好地分离.结论 所建方法可快速有效地分离钩藤碱及异钩藤碱并测定植物中钩藤碱的含量.     

HPLC法测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱含量

目的建立中药钩藤中钩藤碱和异钩藤碱含量的高效液相色谱检测方法,为中药钩藤中有效成分的含量测定提供科学的参考。方法高效液相色谱条件为:色谱柱Phenomenex C18(250nm×4.0nm,5μm),流动相:甲醇-水(55∶45),紫外检测波长:254nm,流速:1.0mL/min,柱温:28℃,进样量:20μL。结果以峰面积为纵坐标浓度为横坐标,计算得到钩藤碱和异钩藤碱回归方程分别为Y=0.999E+6x-21133,R2=0.9998和Y=1.008E+6x-13556,R2=0.9999。结果显示钩藤碱和异钩藤碱分别在0.244～1.534μg和0.226～1.288μg浓度范围内其浓度与峰面积具有良好的线性关系。另外本法在精密度、稳定性、重复性上均取得了较好结果。结论高效液相色谱法测定钩藤中藤碱和异钩藤碱含量,具有快速、简便、重复性好的特点,值得在中药含量测定上大力推广应用。     

HPLC法测定安乐片中钩藤碱和异钩藤碱的含量

目的：建立安乐片中钩藤碱和异钩藤碱的含量测定方法。方法：用高效液相色谱法Agilent XDB C₁₈(250 mm×4.6 mm,5μm);甲醇-0.2%氨水溶液(60:40)为流动相;检测波长为245nm,流速为1 mL.min_-1,柱温25 ℃。结果：钩藤碱进样量在0.0285～0.7133ug(r=0.9999)与峰面积线性关系良好;异钩藤碱进样量在0.0166～0.416ug(r=0.9998)范围内线性良好, 钩藤碱的平均回收率为98.61%,RSD为1.56%,异钩藤碱的平均回收率为97.49%,RSD为1.27%。结论：本法灵敏、准确,专属性强,能简便有效的控制安乐片中钩藤碱和异钩藤碱的含量。     

ACE2通过下调AT1R和ERK1/2的磷酸化而抑制平滑肌细胞的增殖

目的 探讨血管紧张素转换酶2(ACE2)对血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)和细胞外基质激酶(ERK)1/2磷酸化水平及细胞增殖的影响.方法 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达;将载有ACE2基因慢病毒表达载体(Lentiviral-ACE2)以感染复数为10(MOI=10)感染平滑肌细胞不同时间(24、48、72、96 h);采用CCK-8法检测平滑肌细胞增殖;Western blot检测ACE2、AT1R及ERK1/2磷酸化水平.结果 目的 蛋白GFP表达量明显增加,慢病毒ACE2的表达量成时间依赖性增加,并且在96 h时蛋白表达量较对照组和空载体组明显升高,(1.22±0.06 vs 0.53±0.03和0.53±0.09,P<0.05,n=4);AngⅡ(10-7 mol·L-1)可以促进平滑肌细胞的增殖,ACE2能够抑制AngⅡ诱导的平滑肌细胞增殖(0.53±0.10 vs 0.68±0.03,P<0.05,n=5);AngⅡ(10-7 mol·L-1)作用平滑肌细胞12 h后AT1R明显上调,同时ACE2明显抑制AngⅡ诱导的AT1R的上调(0.34±0.01 vs 0.73±0.07,P<0.05,n=4); ACE2能够明显抑制AngⅡ诱导的ERK1/2的磷酸化水平 (0.43±0.06 vs 0.71±0.08,P<0.05,n=4).结论 ACE2可以通过下调AT1R和/及ERK1/2 的磷酸化水平而抑制平滑肌增殖,提示ACE2的过表达具有血管保护作用.     

HPLC测定黔产钩藤不同部位钩藤碱和异钩藤碱的含量

目的 HPLC测定黔产钩藤不同部位中钩藤碱和异钩藤碱的含量,并比较其差异。方法 以钩藤碱、异钩藤碱为对照品,采用CAPCELL PAK C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,以乙腈-0.1%三乙胺水溶液（1%磷酸调pH=9）为流动相,流速1 mL·min^-1,检测波长245 nm,柱温30℃,进样量10µL。结果 钩藤碱与异钩藤碱分离良好,线性、重复性以及回收率均符合要求,钩藤不同部位中的含量存在差异,由高到低依次为皮 > 茎 > 带钩茎枝 > 叶,而茎薄壁组织与木质部未检测到钩藤碱与异钩藤碱。结论 该含量测定结果为钩藤资源的充分利用提供了科学依据。     

钩藤总碱缓释滴丸的热稳定性实验

目的研究钩藤总碱缓释滴丸中钩藤总碱、钩藤碱、异钩藤碱的热稳定性。方法钩藤总碱缓释滴丸在25、40、60℃下分别放置90、180、270 d,酸碱滴定法测定钩藤总碱含量,高效液相法测定钩藤碱及异钩藤碱的含量。结果钩藤总碱和钩藤碱在25、40、60℃下270 d内无明显降解,异钩藤碱在40℃第180天检测时出现含量明显降低(P<0.05),60℃时第90天出现明显降低。结论钩藤总碱缓释滴丸在常温下稳定,但在较高温度下可致主要有效成分含量降低。     

小檗碱对血管紧张素Ⅱ诱导豚鼠结肠平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察小檗碱对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的培养豚鼠结肠平滑肌细胞(SMC)增殖的影响.方法 组织贴块法培养的豚鼠结肠平滑肌细胞随机分成7组:对照组,模型组,小檗碱组(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L),硝苯地平组和溶剂组.分别测定MTT(四甲基偶氮唑盐微量酶)吸收数值和细胞周期中各期细胞构成比.结果 AngⅡ(0.1μmol/L)作用24h能使MTT吸收数值明显增加,并使SMC的C0/G1期细胞减少,细胞增殖指数增大.与AngⅡ组相比,AngⅡ加小檗碱(10μmol/L)组,AngⅡ加硝苯地平(10μmol/L),活细胞数减少,G0/G1期的细胞构成比增加,细胞增殖指数减少.结论 Ang Ⅱ对SMC有促增殖作用,能被小檗碱所拮抗.     

钩藤碱和异钩藤碱对~(45)Ca转运的影响

在离体家兔主动脉条.钩藤碱和异钩藤碱明显减少KCl(77.0 mmol·L~(-1))溶液所致45Ca内流量、不影响去甲肾上腺素所引起的45Ca内流和外溢。结果表明.钩藤碱和异钩藤碱对电位依赖性钙通道具有阻滞作用。     

异钩藤碱对脂多糖诱导的星形胶质细胞炎性介质释放的抑制作用

目的:观察异钩藤碱对LPS诱导的星形胶质细胞炎性介质释放的影响.方法:分离并鉴定新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞,用1μg·mL<'-1>LPS激活原代星形胶质细胞,刺激其分泌IL-1β、TNF-α和NO,并大量表达iNOS mRNA.用不同浓度的异钩藤碱和LPS与星形胶质细胞共孵育.检测异钩藤碱处理后细胞培养液中这些炎性因子释放的含量.结果:异钩藤碱有效地抑制了LPS诱导的星形胶质细胞炎性介质释放,并降低了iNOS mRNA的表达水平.结论:异钩藤碱具有较好的中枢炎症抑制作用,为传统中药钩藤作为治疗缺血性脑病药物提供了科学依据.     

钩藤总碱中钩藤碱和异钩藤碱定量方法的建立及稳定性试验

目的建立钩藤总碱中钩藤碱和异构藤碱的含量测定方法并对其稳定性进行研究。方法采用C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm),甲醇∶0.1 mol/L三乙胺溶液(冰醋酸调pH 7.5)44∶56为流动相,流速为1.0 ml/min。检测波长254 nm。比较分别放置在室温、6℃条件下的同一批次2份总碱中钩藤碱、异构藤碱的含量变化。结果钩藤碱进样量在0.020 2～0.101 mg/ml线性关系良好,r=0.999 9;异构藤碱进样量在0.020 6～0.103 mg/ml线性关系良好,r=0.999 9,钩藤碱平均回收率为99.67%,RSD为0.97%;异钩藤碱平均回收率为99.95%,RSD为1.02%。结论建立的方法简便、准确,可作为钩藤总碱的含量测定方法;钩藤碱、异构藤碱不稳定,可随时间延长含量下降,且温度对二者皆有影响,对钩藤碱影响较大。     

淡豆豉异黄酮对增殖血管平滑肌细胞JAK2/STAT3信号转导通路的影响

目的探讨淡豆豉异黄酮对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)诱导大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖及Janus激酶2-细胞信号转导及转录活化因子3(JAK2/STAT3)信号通路的影响。方法建立AngⅡ诱导VSMC增殖模型,MTT法检测VSMC增殖活性;RT-PCR法检测AngⅡ1型受体(angiotensin Ⅱreceptor1,AT1R)mRNA表达;Westernblot法检测JAK2/STAT3信号通路蛋白JAK2,STAT3及其磷酸化表达水平。结果100、200μg·L-1淡豆豉异黄酮可明显抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖,并明显下调AT1R mRNA表达水平;200μg·L-1淡豆豉异黄酮可明显下调磷酸化JAK2、磷酸化STAT3的表达。结论淡豆豉异黄酮可抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖,其机制可能与下调AT1R表达,阻断JAK2/STAT3信号通路的磷酸化有关。     

钩藤碱含量测定方法研究进展

钩藤碱是中药钩藤中的主要生物碱之一,目前测定钩藤药材中异钩藤碱含量,主要采用高效液相色谱、反相高效液相色潽、高效毛细管电泳、非水毛细管电泳、薄层色谱、薄层色谱傅里叶变换表面增强喇曼散射等方法。本文就上述内容作一综述。     

盐酸小檗碱对人黑色素瘤A375-S2细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

摘要：目的:探讨盐酸小檗碱对人黑色素瘤A375-S2细胞增殖、凋亡以及核因子κB（NF-κB）通路相关蛋白表达的影响。方法:体外培养A375-S2细胞,实验分为对照组（不添加任何药物处理）、盐酸小檗碱高、中、低剂量组(25,50,100μmol·L-1)、阳性对照组(顺铂,0.01 mmol·L-1)。采用CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡以及周期分布情况;免疫印迹法（WB）检测细胞中NF-κB的抑制蛋白α（IκB-α）、p-NF-κB、NF-κB、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-caspase3）蛋白表达情况。结果:与对照组相比,盐酸小檗碱不同剂量组A375-S2细胞增殖抑制率、凋亡率、G1期DNA量、IκB-α、Bax、cleaved-caspase3蛋白表达均显著升高,p-NF-κB、Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.05）,且盐酸小檗碱高剂量组、阳性对照组与盐酸小檗碱中、低剂量组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,高剂量组与阳性对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:盐酸小檗碱可明显抑制人黑色素瘤A375-S2细胞增殖并诱导细胞凋亡,其可能与引起细胞周期G1期阻滞及抑制NF-κB信号通路激活有关。     

仙茅苷对脂多糖诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移及表型转化的影响

目的 观察仙茅苷（curculigoside,Cur）对脂多糖（LPS）诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）发生细胞增殖、迁移以及促进其表型转化的影响,并对其机制进行初步探讨。方法 体外分离培养大鼠血管平滑肌细胞,将血管平滑肌细胞 随机分为对照组、脂多糖组、脂多糖+不同浓度仙茅苷组及仙茅苷组。采用噻唑蓝(MTT)比色法观察并计算各组细胞增殖率;采用细胞划痕实验观察并计算细胞迁移率。应用 Western blot法检测各组细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及核转录因子κB（NF-κB）信号通路相关蛋白表达情况。结果 与对照组相比,脂多糖组细胞增殖率、迁移率及细胞内核转录因子κB及基质金属蛋白酶9蛋白表达水平明显提高（P<0.001）,而α-平滑肌肌动蛋白表达明显降低（P<0.001）;与脂多糖组相比,脂多糖+仙茅苷组细胞增殖率、迁移率以及细胞内基质金属蛋白酶9、核转录因子κB蛋白表达水平明显下降（P<0.001）,α-平滑肌肌动蛋白表达水平明显上升（P<0.001）。结论 仙茅苷可明显抑制由脂多糖诱导的血管平滑肌细胞表型自收缩表型向合成表型转化,进而抑制血管平滑肌细胞的增殖与迁移能力。其作用机制可能与核转录因子κB信号通路相关。     

Losartan和CGRP对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的比较非肽类血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型阻断剂氯沙坦(Losartan)和血管活性肽降钙素基因相关肽(CGRP)对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖作用的影响,为探讨此两类物质的降压机制提供实验依据。方法采用MTT,3H-参入法和流式细胞仪分别测定血管紧张素Ⅱ刺激下,Losartan或CGRP干预下血管平滑肌细胞的增殖变化,W est-ern b loting法测定不同状态下血管平滑肌细胞内ERK1/2的活性变化。结果Losartan或CGRP能抑制血管紧张素Ⅱ刺激下血管平滑肌细胞的生存率、DNA合成、细胞周期增殖指数,以及细胞内ERK1/2的活性,并呈剂量依赖性。而且,CGRP抑制作用强于Losartan。结论Losartan或CGRP能抑制血管紧张素Ⅱ刺激下血管平滑肌细胞增殖,其细胞内的信号传导途径与ERK1/2有关。