促性腺激素在促排卵周期未成熟卵母细胞体外培养中的应用

目的 评价卵泡刺激素和人绒毛膜促性腺激素在促排卵周期未成熟卵母细胞体外培养过程中的应用价值。方法 收集控制性超促排卵周期行单精子显微注射(ICSI)过程中得到的未成熟卵母细胞(MⅠ期和GV期), 随机分为加促性腺激素培养组和不加促性腺激素培养组, 培养24~28 h后成熟卵母细胞进行ICSI授精, 并观察胚胎发育情况, 记录成熟率、受精率、卵裂率和优胚率。结果 对于MⅠ期卵母细胞, 是否使用促性腺激素不影响其24 h成熟率、受精率、分裂率和优胚率(P>0.05)。对于GV期卵母细胞, 培养液中加入促性腺激素能提高优质胚胎率(31.3% vs 4.2%, P<0.05), 但两组的成熟率、受精率和卵裂率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 控制性超促排卵中获得的未成熟卵母细胞进一步体外培养, 无论是否添加促性腺激素都可自然成熟, 在GV期卵母细胞的体外培养过程加入促性腺激素可获得更高的优胚率。     

小鼠生殖泡期卵母细胞体外培养成熟、受精和胚胎发育的研究

为研究性成熟小鼠生殖泡期(GV)卵母细胞的体外成熟,同时比较体外成熟(IVM)和体内成熟组卵子的受精、胚胎发育情况,机械法分离性成熟小鼠卵巢中的GV期卵母细胞及刺激后的成熟卵母细胞,直接培养于[α-MEM+1 mg/ml Fetuin+10％FCS+1.5 IU/ml rHCG±5 ng/mlrEGF]中,16 h后移入f-HTF+10％FCS体外受精4 h,再在M16+10％FCS中培养72 h。记录其成熟、受精和胚胎发育情况,并与体内成熟的卵子比较。结果:GV期卵母细胞在含HCG培养液中成熟率为89.68％,培养液中添加EGF后,卵子成熟率无显著上升,但受精率、卵裂率均有显著提高(P<0.05)。体内成熟卵子的受精率可达62.83％,卵裂率60.18％;IVM组受精率仅48.92％,卵裂率36.69％,明显低于前者(P<0.01)。结论:小鼠GV期卵母细胞可体外培养成熟、受精和胚胎发育。培养液中添加促性腺激素和EGF都促进卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育能力。但IVM组卵母细胞的受精率、卵裂率低于体内成熟组,培养系统仍需改进。     

排卵前成熟卵泡液对卵母细胞体外成熟的影响

目的 :探讨成熟卵泡液、促性腺激素对人类生殖泡期 (germinalvesicle,GV)不成熟卵母细胞体外成熟 (invitromaturation ,IVM)的影响。方法 :在基本培养液中加入 5 0 %成熟卵泡液 (folliclefluids ,FF) (Ⅰ组 )、或促性腺激素 (gonadotrophin ,Gn) (Ⅱ组 )或单用基本培养液即对照组 (Ⅲ组 )用于GV期卵母细胞的体外培养 ,观察成熟率及进一步发育能力。结果 :三组之间GVBD(生殖泡期破裂 )率差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,MⅡ期率和受精率 ,Ⅰ、Ⅱ组明显高于Ⅲ组 (P <0 .0 1)、Ⅰ组与Ⅱ组之间无差异 (P >0 .0 5 ) ;Ⅰ组卵裂至 8细胞的比例为 6 2 .5 % ,明显高于Ⅱ组的33.3% (P <0 .0 1)。结论 :GV期卵母细胞尽管在基本培养液中可完成核成熟 ,但胞质不成熟 ,加入 5 0 %FF或Gn均能促卵母细胞的成熟 ,两者相比 5 0 %FF效果更好。     

LH与hCG对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的研究促黄体素（LH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法小鼠经注射孕马血清促性腺激素（PMSG）48h后，摘取卵巢获得未成熟卵母细胞，分别在含不同浓度的LH和hCG的成熟液中，或将LH和hCG以不同的浓度组合加入到成熟液，进行体外成熟。结果经15.16h的成熟培养，5个浓度LH组中的极体率均高于对照组，其中200IU/mL组显著高于50IU/mL、400IU/mL、300IU/mL组和对照组（P〈0.05）；5个浓度hCG组的极体率与对照组极体率无显著差异（P〉0.05）；协同组中15IU/mL hCG＋200IU/mL LH组的极体率显著高于对照组和其它各处理组。结论LH对小鼠卵母细胞的体外成熟有一定的促进作用。     

猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻保存的研究

猪卵母细胞由于脂肪含量高,对低温敏感,相较其他动物卵母细胞的冷冻保存更加困难,因此在种质的保护保存、胚胎工程研究产生极大的阻碍。本试验研究了猪卵母细胞的OPS玻璃化冷冻保存方法,研究乙二醇、甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为冷冻保护剂,对比不同的浓度梯度和两种冷冻保护剂联合使用对冷冻效果的影响。研究未经体外成熟培养和不同时间体外成熟培养的猪卵母细胞的冷冻保存效果。对比改良优化的OPS玻璃化冷冻方法和传统的程序化冷冻方法的保存效果。实验表明,体外成熟12h(GV期)的猪卵母细胞用乙二醇添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)进行玻璃化冷冻,解冻后体外成熟率、细胞的形态正常率与未经体外成熟的的卵母细胞相比差异显著,与成熟48h(MII期)卵母细胞相比差异不显著。但卵裂率和桑椹胚囊胚率体外成熟12h(GV期)的猪卵母细胞用乙二醇添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为冷的保护剂组要好于其他组。     

雌二醇和孕酮对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的 研究雌二醇(E2)、孕酮(R4)对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响.方法 小鼠经注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后48 h,摘取卵巢获得未成熟卵母细胞,分别在单独含不同浓度的E2或R4的成熟液中,或在同时含有不同浓度E2和P4的成熟液中,进行体外成熟,并对经过E2和P4处理成熟的卵母细胞进行体外受精.结果 经15～16 h的成熟培养,各E2处理组的卵母细胞第一极体排出率虽然均略高于对照组,但它们之间无显著差异;各组卵母细胞体外受精48 h后,1000 ng/mL E2处理组的卵裂率显著低于其他各处理组和对照组,但各组的囊胚率之间无显著差异.各P4处理组的极体率和卵裂率,与对照组相比无显著差异,但是各处理组的囊胚率均极显著低于与对照组;两种激素协同处理组中[1000 ng/mL E2 1000 ng/mL P4]组的极体率显著高于其他各处理组;而与对照组的极体率差异不显著.结论 P4对小鼠卵母细胞的后期发育能力有一定的抑制作用,而E2却对小鼠卵母细胞的成熟及其发育潜力无明显作用.     

17β-雌二醇对小鼠卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

目的:探讨培养液中添加17β-雌二醇(17β-E2)对小鼠生殖泡期(GV)带卵丘细胞卵母细胞体外成熟、受精及其胚胎发育的影响.方法:小鼠生殖泡期卵母细胞随机分为2组:对照组(n=61,TCM199基础培养液加体积分数10%胎牛血清加75 U/L 卵泡刺激素加0.5 kU/L 人绒毛膜促性腺激素加0.05 g/L青霉素加0.075 g/L链霉素)和17β-E2组(n=66,对照组液加1 mg/L 17β-E2),培养后对成熟的卵母细胞行胞浆内单精子显微注射,观察受精及胚胎发育情况.结果:17β-E2组卵母细胞的桑葚胚、囊胚形成率均高于对照组(P均<0.05).结论:成熟培养液中加入17β-E2有助于小鼠未成熟有卵丘细胞卵母细胞的体外成熟及受精后胚胎发育.     

人胎儿卵巢培养时雌二醇的分泌

19例16～30孕周的人胎儿卵巢经体外培养以观察培养前、后及加入不同比例促性腺激素培养后培养液中雌二醇(E_2)值的释放值,培养时间最长达6d。经体外培养的卵巢组织均具有分泌E_2的能力。16～19 6/7周的胎儿卵巢与FSH、LH培养1d,比不加激素组产生更多的E_2(P<0.05)。说明人胎儿卵巢自16周起就具有对促性腺激素作出反应的能力。24～30周的卵巢在加入FSH:LH为4:1(FSH1.33IU/ml,LH0.33IU/ml)经3d培养,可以产生更多的E_2(P<0.05)。上述现象与人胎儿卵巢的形态学研究资料相符。     

乐芮(Luveris)与果纳芬(Gonal-F)对牛未成熟卵母细胞体外发育潜力的影响

目的:探讨黄体生成素乐芮药物(Luveris,L)及卵泡刺激素果纳芬药物(Gonal-F,G)对体外未成熟牛卵母细胞成熟培养的影响。方法:购买商品化的牛未成熟卵母细胞2 000枚,分为2组,Luveris组及Gonal-F组,每组1 000枚。每组根据药物浓度0、5、10、20、40IU/mL再分组培养,培养24、48h后,解剖显微镜下评估COCs扩展程度,倒置显微镜下对卵母细胞核成熟(GV,MI,MⅡ)及第一极体排出情况进行评估。结果:Luveris及Gonal-F均随剂量依赖性显著性促进COCs的扩展。L与G培养24h和48h卵母细胞MⅡ成熟率分别是20IU/mL L为33.3%和37.5%,40IU/mL L为33.3%和53.6%;20IU/mL G为15.1%和16.2%;40IU/mL G为38.9%和39.5%。结论:黄体生成素可以像卵泡刺激素一样在卵泡发育早期促进体外牛卵母细胞的成熟发育,可以延迟卵母细胞GVBD。     

不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻

目的 比较显微授精治疗周期中剩余的生发泡(GV)期不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻效率.方法 将显微授精(ICSI)周期剩余的GV期卵母细胞随机分为3组:①在GV期玻璃化冷冻,解冻后进行体外成熟培养;②体外成熟培养至MII期后行玻璃化冷冻;③对照组:直接进行体外成熟培养(IVM).观察体外培养成熟卵母细胞及不同成熟阶段卵母细胞冷冻后的受精和发育潜力.结果 对照组的成熟率为71.6%(53/74),其中16枚行显微授精(ICSI),受精率为87.5%(14/16),卵裂率为85.7%(12/14),囊胚形成率为14.3%(1/7);组1与组2的存活率分别为97.5%(39/40)和87.5%(35/40),差异没有显著性;但是组1的成熟率28.2%(11/39)显著低于(P<0.01)对照组的成熟率71.6%(53/74);组2的受精率74.1%(20/27)与对照组的受精率87.5%(14/16)相比,差异没有显著性.结论 ICSI周期剩余的GV期卵母细胞能在体外培养成熟并具有良好的发育潜力,将GV期卵母细胞体外成熟培养至MⅡ期更适合于玻璃化冷冻保存.     

Comparison of cleavage activity in vitro between two ribozymes targeted against different sites of PDGF receptor β subunit

Objective: To compare the cleavage activity of ribozymes directed against 2 sites of PDGF receptorP subunit cDNA gene in vitro. Methods: The 608 bp fragment of PDGF receptor β subunit cDNA was clonedinto T-vector under the control of T7 promoter, named pPDGFR-β. Two ribozymes were designed to cleavethe CUU sequence at codon 45 and codon 252 of PDGF receptor β subunit mRNA respectively. These 2 ham-merhead ribozyme genes were cloned into vector PI. 5 between 5' -cis ribozyme and 3' -cis ribozyme to gener-ate the plasmids of pRZ1 and pRZ2. The pPDGFR-β, pRZl and pRZ2 were linearized and then transcribedwith T7 promoter in vitro. Results: The RZ1 showed high cleavage activity in vitro, but the RZ2 showed nocleavage activity under the same condition. Conclusion: The cleavage site selection is an important factor in-fluencing the cleavage activities of ribozymes.     

猪蛔虫幼虫体外培养的初步研究

目的研究适合猪蛔虫幼虫体外培养的最佳条件。方法将猪蛔虫幼虫在不同培养液（KW-2、RPMI-1640、DMEM（含酚红）、DMEM（不含酚红））中进行培养,并观察其存活、生长以及发育情况。结果幼虫在KW-2培养液中生长情况最好,虫体活力很强,3d后成活率最高达87.67%,其次是在RPMI-1640培养液中。在培养液DMEM（含酚红）、DMEM（不含酚红）中生长情况较差,存活不超过7d。其中KW-2培养液中在4～5d出现虫体头端有松动的鞘出现,在RPMI-1640培养液中7～8d出现鞘松动,DMEM（含酚红）、DMEM（不含酚红）中未发现有脱鞘现象出现。结论猪蛔虫的体外培养的最佳条件还需要进一步探索,从而为研究寄生线虫的发育生物学以及特异性发育的功能基因组学奠定基础。     

In-vitro Maturation of Immature Oocytes from Preantral Follicles in Prepuberal Mice

Objective To observe the morphological changes in in vitro growth of preantral follicle isolated from prepuberal mice and to assess impacts of gonadotropin （Gn）, insulin transferrin selenium （ITS） and epidermal growth factor （EGF） on their development. Methods Early preantral mice follicles （90-130μm diameter） were mechanical isolated and selected from 2 weeks＇ old mice and then cultured in alpha-minimal essential medium （α-MEM） with or without Gn, ITS and EGF. The preantral follicles were cultured singly in 20 miovliters droplets for up to 14 d. The medium was replaced and the .follicles were observed everyday. Granulosa cells （GC） prolification, antrum formation and oocyte maturation were recorded. Results The medium with Gn supported preantral follicle culture in vitro, during which they retained a three-dimensional structure, maintained oocytes viability and increased in diameter and number of somatic cells＇. Preantral follicles cultured in Gn medium grew obviously, while those without Gn grew slowly and after 6 d＇s culture began to shrink and blacken. Significant increase in survival rate and maturation rate of oocytes was observed in Gn group （P〈0.01）, with 92.9% survived and 28.7%formed an antrum. Further supplementation of the Gn medium with ITS and rLH, resulted in the significant increase in survival and maturation of preantral follicle （P〈0.05） Conclusions α-MEM can be the medium for in vitro culture （IVC） of preantral follicles, but need to be added with rLH/rFSH, rHCG/rEGF to facilitate thecal cell attachment, GC proliferation and oocyte maturation.     

小鼠窦前卵泡的体外培养

目的 观察性成熟前小鼠的窦前卵泡体外培养的形态学改变,同时评价激素及生长因子等添加物对窦前卵泡体外发育的影响。方法 机械法分离性成熟前小鼠卵巢中的窦前卵泡,分2组培养于20μL培养液滴内。(1)Gn组:α-MEM 10％FCS 100 mU/mL rFSH±ITS(5 μg/mL insulin,5 μg/mL transferrine,5 ng/mLselenium)±10 mU/mL rLH,第12天移入 α-MEM 1.5 U/mL rHCG 5 ng/mL rEGF 10％ FCS。(2)nGn组:α-MEM 10％ FCS。每天换液观察,记录GC增生、窦形成等形态学改变和卵母细胞成熟情况。结果 激素组窦前卵泡增长明显,92.92％存活,28.65％形成窦,培养14d后40.35％排出成熟卵;而无激素组窦前卵泡生长缓慢,生存6d后开始萎缩、变黑,存活率仅10.91％,无窦卵泡形成,仅11.11％排出成熟卵,差异有显著意义(P<0.01)。激素组在添加ITS、LH后,窦前卵泡的窦形成率和排出成熟卵母细胞率均显著上升(P<0.05)。结论 α-MEM可作为窦前卵泡体外培养液,但必须添加rLH/rFSH、ITS、rHCG/rEGF以促进膜细胞黏附、颗粒细胞增生和卵母细胞成熟。     

山羊体外受精的研究

通过在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加不同的血清和不同浓度的卵泡液 ,在体外成熟培养液中培养不同的时间 ,以及采用不同的精子获能方法来摸索效率较高的体外受精方法体系。在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加FCS、EGS及不同浓度的卵泡液 ,成熟培养时间分别为 16、2 0、2 4和 2 7h ,山羊新鲜精液用钙离子载体法和肝素法进行获能处理后用于体外受精 ,比较其体外成熟率和体外受精率。添加FCS、EGS和 2 0 %卵泡液组的成熟率无显著差异 ,显著高于添加 10 %和 3 0 %卵泡液组的成熟率 ;但添加FCS和EGS组的受精率显著高于添加10 %、2 0 %、3 0 %卵泡液组的受精率。培养 2 4h组和 2 7h组的成熟率显著高于另外两组 ,而培养 2 7h组的受精率显著高于其余各组。用钙离子载体法处理的山羊精子的顶体反应率和体外受精率显著高于肝素法。EGS可以代替FCS添加于成熟培养液中 ,对COCs的成熟率和受精率没有明显的影响 ,但卵泡液不能完全代替FCS的作用。培养时间为 2 7h ,精子用钙离子载体法处理获能后能得到较高的体外受精率     

未成熟卵母细胞体外培养治疗不孕症的临床研究

目的:评价未成熟卵母细胞体外培养成熟(IVM)治疗不孕症的临床价值.方法:40例不孕患者接受54个IVM周期治疗,包括26例难治性多囊卵巢综合征(PCOS)和14例月经周期正常但经其他辅助生育技术失败的患者.测定卵泡早期的性激素、抑制素-A(INH-A)、抑制素-B(INH-B).未经任何药物刺激,于月经周期的9～12 d在超声引导下经阴道对两侧卵巢内的小卵泡进行穿刺获卵.体外培养24～48 h,进行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI),18 h后观察受精情况,继续培养24～48 h,直至胚胎移植,移植前行激光辅助孵化.结果:7个周期取消,取消率为13%(7/54).1例生化妊娠,19例临床妊娠,每取卵周期的临床妊娠率为35.2%(19/54),每移植周期的临床妊娠率为40.4%(19/47).47个移植周期共获得未成熟卵母细胞857个,平均每周期18.2个,体外培养48 h后总成熟率为73.7%(632/857),正常受精率为75.3%(476/632),卵裂率为91.2%.妊娠组的获卵数显著多于非妊娠组[(22.4±16.2)个vs(15.2±7.1)个,P＜0.05],取卵日和胚胎移植日的子宫内膜厚度显著大于非妊娠组[(8.0±1.5)cm vs(6.8±0.9)cm;(9.5±1.6)cm vs(8.3±1.3)cm,P＜0.05],但两组患者的年龄、不孕年限、体重指数、基础性激素、INH-A、INH-B各参数相比均无显著性差异.结论:未经药物刺激的IVM技术是治疗不孕症的一种有效方法,获卵数和子宫内膜厚度与成功率有关.     

离体电转染pCAGGS．EGFP对小鼠视网膜神经节细胞的标记

目的：通过离体电转染将GFP对胚胎期小鼠视网膜神经节细胞（RGC）进行标记来观察其形态．方法：剥离胚胎小鼠E14的视网膜连同晶状体,放入定制的电转杯中进行电转染,以8～16V电压将pCAGGS—EGFP质粒导入RGC,体外培养视网膜1～5d,观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况。结果：以12V,50ms,950InS的间隔,5个脉冲转染效率最高,为81．25％：20～144h期间GFP依次由胞体向轴突、树突扩散分布。结论：在体外培养基中培养1～5d．pCAGGS—EGFP经过最适电压转染后能够在小鼠视网膜神经节细胞中持续扩散表达.     

维生素E对人胚胎凋亡及体外发育的影响

目的探讨抗氧化物维生素E（Vitamin E）对人类体外培养胚胎凋亡及体外发育的影响,并观察培养过程中胚胎凋亡的形态学变化。方法以常规体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryotransfer,IVF-ET）后废弃的胚胎为材料,培养过程中添加抗氧化物质维生素E,观察其对胚胎体外发育的影响,采用TUNEL方法对胚胎进行染色,观察其凋亡情况;用Hoechst33342对胚泡进行荧光染色,根据胚泡细胞总数及凋亡形态学变化对其凋亡进行检测。结果当添加100μmol维生素E时,与对照组相比,显著提高人类扩张期囊胚形成率和孵化率（P〈0.05）,降低其凋亡率（P〈0.05）。结论维生素E能够降低人类囊胚的凋亡率,提高其体外发育率。     

体外受精周期中不同改行时机对未成熟卵体外培养结局的影响

目的：探讨常规体外受精周期中,不同改行时机对未成熟卵体外培养结局的影响。方法：回顾性分析2008年1月至2009年12月,在温州医学院附属第一医院生殖医学中心行常规体外受精（in vitrofertilization,IVF）过程中为预防出现卵巢过度刺激综合征或因卵泡发育迟缓,改行未成熟卵体外培养（in vitro maturation,IVM）的91例患者,按促性腺激素（gonadotropin,Gn）使用天数不同分为两组,A组使用Gn 5～7 d,共51例,B组使用Gn 8～13 d,共40例。比较两组的一般指标、Gn用量、体外成熟与胚胎发育及妊娠结局。结果：两组年龄、不孕年限、基础激素水平均差异无统计学意义（P〉0.05）。Gn使用量A组明显低于B组,但获卵数A组明显高于B组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。取卵日的雌激素以及黄体生成素水平A组明显高于B组,而孕激素水平则B组高于A组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。两组的卵子成熟率、受精率、卵裂率、优胚率、种植率差异均无统计学意义（P〉0.05）。两组的移植周期率、hCG阳性率、周期取消率、临床妊娠率、多胎妊娠率、自然流产率、异位妊娠率等临床结局差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：体外受精咛ヒ浦仓芷谥校煌被男蠭VM均能获得较好的临床结局,但Gn使用后5～7 d比8～13 d可以显著减少促排卵药物的用量,增加获卵数,降低治疗费用。     

利用饲养细胞体外扩增高纯度的效应NK细胞

目的 比较两类饲养细胞（FC）体外扩增自然杀伤（NK）细胞的效果,鉴定出特定的NK细胞群并进行功能性分析,从而确定最优的FC。方法 构建两类FC,分别是第1代FC（FC-000,K562-41BBL）和第2代FC（FC-002,K562-41BBL-mbIL15-mbIL21）,分别与人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）共培养14d,收获细胞,流式细胞术鉴定NK细胞表型,利用实时无标记细胞分析仪检测两类NK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤能力。结果 培养14d后,FC-002扩增的NK细胞纯度（93.5%）高于FC-000扩增的NK细胞（70.2%）（P<0.05）;FC-002扩增的NK细胞增殖倍数（3325）高于FC-000扩增的NK细胞增殖倍数（10）（P<0.05）。两者均促进了具有NKG2D、NKp44、CD69功能性受体的NK细胞群增殖,且FC-002扩增的NK细胞具有更高的肿瘤杀伤能力及干扰素-γ表达能力（P<0.05）。结论 利用FC能够在体外有效地扩增高纯度的NK细胞,并能够选择性扩增具有NKG2D、NKp44、CD69功能性受体的NK细胞群,且第2代FC所扩增的NK细胞对于肿瘤细胞具有更强的杀伤能力,并在NK细胞增殖倍数、纯度上均优于第1代FC。