双氯芬酸对人巨噬细胞钾通道Kv1.3、Kir2.1表达的抑制作用及其对膜电位和泡沫细胞形成的影响(英文)

目的分研究双氯芬酸对人巨噬细胞电压依赖性钾通道Kv1.3、内向整流钾通道Kir2.1表达的影响及意义。方法以健康人外周血单核细胞源性巨噬细胞为对象,采用Real-time RT-PCR及Western blot技术研究双氯芬酸对Kv1.3和Kir2.1表达的影响;电压敏感染料膜电位标测技术分析膜电位的变化,并用酶荧光化学法检测摄取氧化修饰低密度脂蛋白(OxLDL)的巨噬细胞内胆固醇酯(CE)的构成比率。结果双氯芬酸(1.5和15μmol/L)抑制巨噬细胞Kv1.3和Kir2.1的表达。同对照组相比,Kv1.3mRNA下降分别超过80%和90%(P<0.05),Kir2.1 mRNA下降分别超过20%和30%(P>0.05);两种钾通道蛋白水平的下降均分别超过10%和60%,且存在明显的剂量依赖性(P<0.05)。同时,双氯芬酸可剂量依赖性减弱巨噬细胞表面的荧光强度,使膜电位分别下降约28%和54%(P<0.05)。巨噬细胞同30 mg/L OxLDL孵育60 h后,细胞体积明显增大,且有许多红色的脂质颗粒沉积于细胞质内,CE/TC的百分比超过50%。1.5和15μmol/L双氯芬酸分别使摄取OxLDL的巨噬细胞内CE的百分比显著减少到(23.624±3.34)%和(13.601±2.916)%,但缺乏明显的量效关系(P>0.05)。结论双氯芬酸显著下调人巨噬细胞Kv1.3和Kir2.1的表达,降低细胞膜电位,并抑制泡沫细胞形成。     

阻断Kv1.3和Kir2.1抑制人巨噬细胞源性泡沫细胞分化

目的:研究泡沫细胞分化过程中离子通道Kv1.3和Kir2.1的表达及作用。方法:用30mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育巨噬细胞60h建立泡沫细胞模型。采用免疫细胞化学、RT-PCR和Western印迹检测人单核细胞源性巨噬细胞和泡沫细胞上Kv1.3和Kir2.1的表达。观察Kv1.3和Kir2.1特异性阻断剂rMargatoxin和BaCl2对巨噬细胞胆固醇代谢的影响。结果:ox-LDL(30mg/L)孵育巨噬细胞60h后,细胞内总胆固醇(TC),游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)显著增加,CE/TC从(14.4±6.8)%提高到(57.9±3.5)%(P<0.05);但Kv1.3和Kir2.1的表达水平在巨噬细胞组和泡沫细胞组无明显区别(P>0.05)。Kv1.3和Kir2.1分别被rMargatoxin(0.1,10nmol/L)和BaCl2(75,125μmol/L)阻断后,细胞内TC和CE水平显著降低,CE/TC低于50%(P<0.05)。结论:Kv1.3和Kir2.1对泡沫细胞的分化均起关键作用,特异性阻断后能够抑制人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化。     

人巨噬细胞源性泡沫细胞分化中Kir2.1通道的表达

目的 Kir2.1通道是控制骨髓源性巨噬细胞增殖、活化和凋亡的重要离子通道之一,并且还参与细胞分化。本研究观察Kir2.1通道mRNA及蛋白在人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中的表达。方法 采用密度梯度离心加贴壁黏附法,从男性健康志愿者的外周血中分离单核细胞,经5d培养后分化为巨噬细胞。在建立人巨噬细胞源性泡沫细胞模型的基础上,采用RT-PCR,蛋白质印迹及免疫细胞化学方法研究Kir2.1通道的表达。结果 将巨噬细胞同30mg/L氧化修饰低密度脂蛋白(OxLDL)于37℃孵育60h后,细胞体积增大,并有许多红色的脂质颗粒沉积于细胞质内,细胞内的总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)的含量分别从(54.79±28.304)mg/g、(47.968±26.787)mg/g和(6.822±3.437)mg/g增加至(229.775±57.453)mg/g、(96.241±24.003)mg/g和(133.535±36.292)mg/g,CE/TC从(14.437±6.781)%提高到[(57.946±3.507)%(n=7,P<0.05)]。但是,Kir2.1通道mRNA的扩增量在巨噬细胞和分化的泡沫细胞之间无显著差异[(59.074±10.566)%vs(46.98±12.527)%,n=5,P＞0.05];同样,Kir2.1通道蛋白在巨噬细胞和分化的泡沫细胞之间亦无显著差异[(60.527±18.621)%vs(50.243±11.583)%,n=6,P＞0.05]。结论 人单核细胞源性巨噬细胞同30mg/LOxLDL孵育60h后可分化为泡沫细胞,但Kir2.1通道的表达无明显改变。     

K+v通道在缺氧性肺血管收缩中的作用研究

目的 探讨K+v通道在缺氧性肺血管收缩（HPV）中的作用。方法Wistar大鼠40只随机分为两组:常氧对照组和低氧组, 采用酶消化的方法获得单个肺动脉血管平滑肌细胞（PASMC）,将分离细胞经a-actin免疫组化鉴定为PASMC。采用膜片钳技术记录PASMC静息膜电位（Em）和电压门控性钾通道电流（Ikv）。细胞内灌流Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3抗体混合液（1：125）,探讨钾通道在HPV中的作用。结果 低氧组膜电位明显去极化,细胞内灌流Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3抗体混合液可显著抑制常氧对照组PASMC的Ikv,使Em去极化,细胞内灌流Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3抗体混合液对低氧组PASMC的Ikv和Em均无显著影响。结论Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3可能是氧敏感型通道,并可能介导了缺氧性肺血管收缩。     

乙酰胆碱（Ach）对 Ca－L和KAch通道相关基因和蛋白水平表达的影响

目的：分析乙酰胆碱（Ach）对 Ca－L和KAch通道相关基因和蛋白水平表达的影响。方法：遵义市第一人民医院心血管内科实验室（遵义医学院分子中心实验室）,在2015年9月至2016年3月期间,选择45只原代培养的SD大鼠乳鼠,将其心房肌细胞分为三组：空白组、去甲肾上腺素（NE）组和乙酰胆碱组,采用实时荧光定量RT－PCR检测三组大鼠乳鼠心房肌细胞的Cav1.2、Cav1.3、Cab2、CaB3、Kir3.1、Kir3.4mRNA的转录水平,采用Westernblotting法测定Ca－L通道和KAch通道蛋白表达强度。结果：（1）去甲肾上腺素组的Cav1.2、Cav1.3、Cab2、CaB3、Kir3.1、Kir3.4mRNA表达水平均低于空白组,其中 Kir3.1、Kir3.4、Cab2、CaB3mRNA与空白组相比,差异有统计学意义（P ＜0.05）。（2）乙酰胆碱组的 Kir3.1、Kir3.4mRNA表达水平均高于空白组,但是相比差异不明显（P＞0.05）,而其Cav1.2、Cav1.3、Cab2、CaB3均低于空白组,均呈现明显差异（P＜0.05）。（3）乙酰胆碱组和去甲肾上腺素组相比,Kir3.1、Kir3.4mRNA表达水平均高,Cav1.2、Cav1.3、Cab2、CaB3mRNA表达水平均低,均呈现明显差异,有统计学意义（P＜0.05）。（4）除Kir3.4外,不同蛋白强度表达均呈现,从空白组,去甲肾上腺素组和乙酰胆碱组的增强反应。结论：Ach可调节心房肌细胞乙酰胆碱敏感性钾离子通道和L型钙离子通道相关基因和蛋白表达,其中对乙酰胆碱敏感性钾离子通道的基因表达调控尤其显著。乙酰胆碱对所有离子通道上的蛋白均有增强作用,说明其参与了增强离子通道上的细胞生长周期。     

慢性心房颤动患者心房肌细胞Kir2.1、Kir3.4和Kv4.3钾通道重构的研究

目的:观察心房颤动(AF)患者心房组织钾通道 IK,ACh、IK1及 Ito1基因水平的改变。方法:将 59 例风湿性心瓣膜病接受心脏外科手术患者分为两组,其中窦性心律(SR)患者 29 例,慢性房颤(CAF)患者 30 例。手术时切取患者右心耳组织,应用RT PCR技术检测心房肌组织 Kir2.1、Kir3.4 和 Kv4.3 mRNA的表达。结果:与 SR组相比,Kir2.1 mRNA的表达在CAF患者中增加明显,达71%(P<0.01),并与 AF时程呈明显正相关(r=0.49,P=0.004)。与之相反的是Kir3.4 mRNA的表达在CAF患者中均显著减少(下降43%,P<0.01),与AF时程呈明显负相关(r=-0.54, P=0.003)。CAF组编码 Ito1的Kv4.3钾通道的mRNA表达较SR组明显下降(下降 60%,P<0.01)。Kv4.3 mRNA表达也与AF时程呈明显负相关(r=-0.67,P=0.003)。结论:慢性房颤患者 Kir2.1的mRNA表达水平增加及Kir3.4和Kv4.3 的mRNA表达水平减少可能分别是 IK1上调、IK,ACh和 Ito1下调的分子基础,而Kir3.4和Kv4.3 mRNA表达水平减少很可能是机体为拮抗AF电重构时有效不应期缩短的代偿机制之一。     

猪急性心肌梗死后钾通道Kv2.1、Kir2.1基因表达的变化

目的:研究猪急性心肌梗死后梗死边缘区钾通道Kv2.1、Kir2.1 mRNA表达的变化。方法:通过结扎猪左前降支中下段2 h后再灌注建立急性心肌梗死模型(MI),手术后存活猪进入MI组,同时设立相应的假手术组(SH),于24 h后取左心室梗死边缘区及假手术组相应部位,应用半定量逆转录-聚合酶链反应方法检测心外膜和心内膜心肌内向整流性钾电流亚单位(Kir2.1)、延迟整流性钾电流亚单位(Kv2.1)mRNA的表达量。结果:Kv2.1基因表达在SH组左心室心内膜和心外膜间没有差异,而Kir2.1基因表达在心内膜高于心外膜(P<0.05),MI组Kv2.1基因表达在心内膜和心外膜都显著下降(P<0.05),而且减少的程度一致,而Kir2.1基因表达只在心外膜层下降(P<0.05)。结论:局部离子通道mRNA表达的下调可能是急性心肌梗死后电生理异质性的一个决定因素,从而增加心肌梗死后电活动的不稳定性。     

美托洛尔对心肌梗死后大鼠心肌钾通道Kv2.1表达的影响

目的:探讨美托洛尔对心肌梗死后大鼠心肌钾通道Kv2.1表达的影响。方法:通过结扎大鼠左前降支近端建立心肌梗死(MI)大鼠模型,手术后存活大鼠随机分入MI组(7d组,30d组)和美托洛尔组(7d组,30d组;美托洛尔8mg/kg/d,2次/d),同时设立相应假手术组。应用半定量RT-PCR方法检测左室心肌(心肌梗死者取非梗死区左室心肌)钾通道Kv2.1 mRNA。结果:7d时,与假手术组比较,MI组和美托洛尔组Kv2.1表达量均显著下降(P<0.05;P<0.01);与MI组比较,美托洛尔组Kv2.1的表达量显著降低(P<0.01)。30d时,与假手术组比较,MI组和美托洛尔组Kv2.1均显著下降(P<0.01,P<0.05);与MI组比较,美托洛尔组Kv2.1显著增高(P<0.05)。MI组:与7d时比较,30d时Kv2.1显著下降(P<0.05)。美托洛尔组:30d比7d时Kv2.1显著升高(P<0.05)。结论:美托洛尔对心肌梗死后钾通道Kv2.1的表达存在双相性影响,但早期下调的意义有待阐明。     

Kv1.3钾通道调节人脐静脉内皮细胞 LOX-1受体摄取oxLDL

目的 观察Kv1.3钾通道在LOX-1摄取oxLDL中的作用,并探讨其机制。方法 分别以慢病毒载体shRNA-Kv1.3-LV3-pGLV-h1-GFP-puro和Kv1.3-LV5-EF1a-GFP-Puro转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),以获得HUVECs细胞中下调和上调表达Kv1.3蛋白。利用全细胞膜片钳技术记录Kv1.3蛋白过表达和下调的HUVECs Kv1.3 I/V曲线。以oxLDL与HUVECs共孵育后,分别应用免疫比色法和Fluo-3/AM荧光标记法测定细胞内胆固醇和钙离子相对含量。经Western blot法测定Kv1.3、LOX-1、p38、p38磷酸化水平。结果 shRNA950转染组HUVECs Kv1.3 mRNA和蛋白表达量较空白对照组显著降低(P<0.05),过表达转染组Kv1.3 mRNA和蛋白表达量较空白对照组显著升高(P<0.05)。Kv1.3表达上调后, I/V曲线上移,该效应可被奎尼丁抑制;Kv1.3表达下调后,I/V曲线下移。Kv1.3过表达组胆固醇相对水平明显高于对照组(P<0.05),shRNA950+oxLDL组胆固醇的相对含量低于oxLDL组(P<0.05)。Western blot法检测显示,Kv1.3过表达组的LOX-1蛋白表达量较对照组升高(P<0.05),Kv1.3敲低组的LOX-1蛋白水平较对照组减低(P<0.05);Kv1.3过表达组磷酸化p38与p38蛋白水平的比值高于对照组二者的比值(P<0.05),Kv1.3敲低组磷酸化p38与p38蛋白表达量的比值低于对照组两者的比值(P<0.05)。结论 Kv1.3钾通道经p38信号通路参与调节HUVECs LOX-1受体摄取oxLDL。该研究为阐明LOX-1结合oxLDL的电荷依赖性机制增添了新的实验依据。     

人巨噬细胞源性泡沫细胞分化中Kir2．1通道的表达

OBJECTIVE: Detected in non-transformed bone marrow-derived macrophages (BMDM) and identified as one of the key channels in modulating macrophage proliferation, activation and apoptosis, Kir2.1 channel is also characterized to play a crucial role in cell differentiation. The purpose of this study was to investigate the expression of Kir2.1 channel mRNA and protein during human monocyte-derived macrophage differentiation into foam cells. METHODS: Human peripheral blood monocytes were isolated from healthy male volunteers by density gradient centrifugation and then by adherence method. The macrophages identified as a homogeneous population of adherent cells were obtained after 5 days of culture. Expression of Kir2.1 channel during human macrophage differentiation into foam cells was investigated by RT-PCR, Western blotting and immunocytochemistry, respectively. RESULTS: After incubation of the macrophages with 30 mg/L OxLDL at 37 degrees C for 60 h, the cells were obviously enlarged in size and numerous red lipid granules observed under optical microscope. The cellular contents of the total cholesterol (TC), free cholesterol (FC) and cholesterol ester (CE) were markedly increased from 54.79+/-28.304 mg/g, 47.968+/-26.787 mg/g and 6.822+/-3.437 mg/g to 229.775+/-57.453 mg/g, 96.241+/-24.003 mg/g and 133.535+/-36.292 mg/g, respectively; the CE/TC ratio rose from (14.437+/-6.781)% to (57.946+/-3.507)% (n=7, P<0.05), suggesting the phenotype of foam cells. However, there was no significant difference in the relative expression of Kir2.1 channel mRNA between the macrophages and foam cells [(59.074+/-10.566)% vs (46.98+/-12.527)%, n=5, P>0.05], nor was there significant difference in the relative expression of Kir2.1 channel protein between them [(60.527+/-18.621)% vs (50.243+/-11.583)%, n=6, P>0.05]. CONCLUSION: Incubation of human monocyte-derived macrophages with 30 mg/L OxLDL for 60 h induces the differentiation of the cells into foam cells, but the expression of Kir2.1 channel does not change obviously.     

Expressions of voltage-gated K+ channel 2.1 and 2.2 in rat bladder with detrusor hyperreflexia

Background Voltage-gated K^＋ channel （Kv） plays a critical role in the modulation of detrusor contraction. This study was conducted to investigate the expressions of Kv2.1 and Kv2.2 in rat bladder with detrusor hyperreflexia （DH）. Methods Thirty adult female Sprague-Dawley rats （200-220 g） were randomly divided into the control group and the experimental group. The experimental group was subjected to spinal cord injury （SCI）. In the controls, the surgical procedure was identical with the exception that dura and spinal cord were transected. Four weeks after SCI, in vivo cystometry and mechanical pulling tests of isolated detrusor strips were performed, mRNA was extracted from the detrusors of normal and DH rats for the detection of expression of Kv2.1 and Kv2.2 by RT-PCR. Differences in expression between normal and overactive detrusors were identified by gel imaging. Results Fourteen rats in the experimental group exhibited uninhibited bladder contraction （〉8 cmH20） before voiding after SCI. One rat died from infection. The frequency of DH in the experimental group was significantly different from that in the control group with or without treatment with 4-aminopyridine （4-AP） （P 〈0.05）, while the amplitude of DH did not change markedly. The rates of variation of the automatic contractile frequency and amplitude were （66.8±12.4）% and （42.6±12.6）% respectively in the control group, and （38.4±9.8）% and （28.0±4.6）% respectively in the DH group. 4-AP increased the automatic contractile frequency apart from the automatic contractile amplitude in both the control and DH groups （P 〈0.05）. 4-AP increased the rate of variation of the automatic contractile frequency more markedly in the control group than in the DH group （P 〈0.05）. Significant expression of Kv2.2 was not detected in bladders in the control group. Compared to the mRNA levels of 13-actin, the mRNA level of Kv2.1 was 1.26±K）.12 in the control group and 0.66±0.08 in the DH group. SCI signific     

姜黄素逆转结肠癌裸鼠移植瘤多药耐药的研究

目的探讨姜黄素体内对人结肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR多药耐药的逆转作用及其可能机制。方法将HCT-8/VCR种植于裸鼠皮下,建立肿瘤耐药模型。移植瘤裸鼠20只依据治疗方法的不同分为对照组(PBS)、长春新碱(Vincristine,VCR;2 mg/kg)组、姜黄素(50 mg/kg)组、姜黄素联合VCR(50 mg/kg姜黄素+2 mg/kg VCR)4组,每组5只。治疗2周后收集标本,称量各组瘤体质量,采用RT-PCR、Western blot分别检测瘤组织内MDR1 mRNA、survivin mRNA和P-gp、survivin蛋白的表达水平,HE染色观察瘤组织细胞形态学变化,评估姜黄素在不同处理因素中逆转肿瘤多药耐药的效果。结果姜黄素联合VCR能显著抑制瘤体的生长,姜黄素联合VCR组瘤质量[(0.42±0.23)g]明显低于对照组[(1.21±0.25)g]、VCR组[(1.13±0.27)g]、姜黄素组[(0.75±0.27)g](P<0.05)。RT-PCR、Western blot结果显示姜黄素能够下调MDR1 mRNA、survivin mRNA和P-gp、survivin蛋白的表达,姜黄素联合VCR组MDR1 mRNA(0.18±0.05)、survivin mRNA(0.63±0.04)、P-gp(0.15±0.02)、survivin(0.31±0.09)和姜黄素组MDR1 mRNA(0.39±0.11)、survivinmRNA(0.80±0.12)和P-gp(0.34±0.07)、survivin(0.40±0.11)蛋白表达明显低于对照组MDR1 mRNA(0.99±0.23)和survivin mRNA(1.19±0.32)表达,以及P-gp(0.71±0.23)、survivin(0.88±0.15)蛋白表达(P<0.05)。HE病理切片显示姜黄素组和姜黄素联合VCR组较其他2组有较多的淋巴细胞浸润,核固缩较多,核分裂相少,坏死更为广泛。结论多种机制参与姜黄素体内逆转肿瘤多药耐药,姜黄素可能通过下调MDR1、survivin mRNA表达和P-gp、survivin蛋白的表达,促进肿瘤细胞凋亡等多种途径逆转肿瘤的多药耐药性。