雪旺氏细胞和成纤维细胞体外培养的实验研究

目的：本实验通过雪旺氏细胞（Ｓｃ）和成纤维细胞（Ｆｂ）不同培养方法的研究来获得不同比例共存的雪旺氏细胞和成纤维细胞。方法。分散培养（１）差速贴壁法。（２）阿糖胞苷自理法。观察（１）相差显微镜，（２）Ｓ－１００免疫细胞化学染色。（３）细胞计数。结果：被Ｓ－１００染色染上雪旺氏细胞在相差显微镜下观察到的活体雪旺氏细胞的开矿是一致的，细胞呈梭形，经差速壁法和阿糖包苷处理后３天雪旺氏细胞所占比例为９５％，     

人胚胎脊髓背根雪旺氏细胞的培养

目的探索人胚胎雪旺氏细胞的分离、培养和纯化的方法,为将来雪旺氏细胞移植奠定基础。方法从胎儿脊髓背根中分离培养雪旺氏细胞,利用雪旺氏细胞与纤维母细胞的不同贴壁特性,综合利用酶消化、时间差和阿糖胞苷抑制等方法,达到分离和纯化人雪旺氏细胞的目的。结果雪旺氏细胞大部份呈梭形,两端有突起,少数呈多角形。免疫组化示这些细胞呈S-100抗原阳性,细胞纯度达99%。结论本方法分离、培养的人雪旺氏细胞纯度高,是一种有效的培养方法。     

小鼠成肌细胞的体外培养及生物学特性的观察

目的：对新生小鼠成肌细胞进行体外培养，并动态观察其成肌过程的生物学特性。方法：分离乳鼠四肢骨骼肌，用DMEM／F－12培养液对成肌细胞进行体外原代培养；倒置显微镜下观察成肌细胞成肌过程的生物学特性；应用透射电镜及免疫细胞化学技术观察小鼠成肌细胞的超微结构及结构蛋白的分布。结果：本实验方法培养的成肌细胞生长分化良好，最终由单个核细胞变为多个核细胞；电镜下显示，成肌细胞胞浆细胞器呈逐步发育成熟过程，成熟的肌细胞富含束状排列的肌丝。免疫细胞化学技术显示，细胞呈α－肌动蛋白阳性，阳性产物多分布在细胞质中。结论：α＝肌动蛋白对鉴定小鼠骨骼肌成肌细胞具有特异性。     

雪旺氏细胞体外培养方法研究

为在短时期内培养大量的雪旺氏细胞，本文对目前常用的两种培养方法进行了比较。方法：采用植块反复种植法和酶消化法分别进行雪旺氏细胞的体外培养。结果表明两种方法都能得到雪旺氏细胞。但酶消化法所培养的雪旺氏细胞生长一致，相同条件下达到一定细胞数量所需时间短于植块反复种植法。酶消化法比植块反复种植法更适用于大量雪旺氏细胞的培养。     

周围神经65KD蛋白单克隆抗体的制备

神经化学诱向生长的研究是神经科学中的一个重要方向。本文以自然系统聚丙酰胺凝胶电泳,分离提取坐骨神经损伤后的远侧端中具有诱神经生长作用的65KD蛋白。以该蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术获得一株(VI5E)稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。免疫印迹法表明,该单克隆抗体特异性地与65KD区带结合。免疫组化法显示,在损伤后的坐骨神经远侧端组织中的雪旺氏细胞呈阳性反应。单克隆抗体的制备为进一步阐明该蛋白的生物学特性奠定了基础。     

脑组织提取液对体外培养雪旺氏细胞影响的观察

目的：了解脑组织提取液对体外培养雪旺氏细胞的影响。方法：酶消化法培养的雪旺氏细胞分烃 加脑组织提取液组,对细胞形态和数量进行观察比较。结果：体外培养的五氏细胞在加入脑组织提取液后细胞增殖加快,并出现细胞突出起细长（为对照组的２－３倍）,互相延伸等形态学改变。结论：雪旺氏细胞在接触脑组织提取液后,表现为细胞增殖加快,突起生长明显的功能活跃状态。     

培养的周围神经组织特殊三色染色法

目的；以特殊三角染色法显示培养的周围神经组织中轴索及雪旺氏细胞等结构。方法：大鼠背根神经体外培养后，用苏木素精，固绿ＦＣＦ，变色素２Ｒ及磷钨酸等配制三色染色液染色。结果：神经轴索呈蓝绿色，雪旺氏细胞核为红色或紫红色，胞质为浅灰色。结论：特殊的三色染色法能区别显示培养的周转神经组织中轴索及雪旺氏细胞。     

雪旺氏细胞凋亡在TNFRⅠ－/－鼠实验性自身免疫性神经炎发病机制中的作用

目的： 建立实验性自身免疫性神经炎（EAN）在肿瘤坏死因子α受体I（TNFRⅠ）基因敲除鼠（TNFRⅠ－/－）的动物模型,进一步研究雪旺氏细胞凋亡在其发病机制中的作用。方法：采用周围神经P0 蛋白180-199肽段皮下免疫方法分别在TNFRⅠ－/－及野生鼠C57BL/6上制备EAN动物模型;连续观察EAN的发病过程、疾病严重程度并进行临床症状评分;免疫后第22天取2组动物雪旺氏细胞进行原代培养,通过流式细胞仪检测Fas及Annexin-Ⅴ（Annexin-Ⅴ+/PI－）在雪旺氏细胞的表达。结果：TNFRⅠ－/－组EAN症状高峰临床评分（1.50±0.19）较野生型组（1.90±0.16）明显减低;TNFRⅠ－/－EAN组雪旺氏细胞Fas阳性表达率为（88.03±1.40）％,野生型组为（94.70±1.53）％,两组比较差异有显著性（P<0.05);Annexin-Ⅴ（Annexin-Ⅴ+/PI－）在TNFRⅠ－/－组雪旺氏细胞的阳性表达率为（8.78±0.94）％,野生型组为（13.03±4.15）％,TNFRⅠ－/－组呈降低趋势,但两组比较差异无显著性（P>0.05)。结论：TNFRⅠ可能通过增加雪旺氏细胞的凋亡进而引起周围神经损伤而加重EAN的临床症状。     

抗PSMA膜外段单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)膜外段的单克隆抗体。方法 原核表达含有PSMA膜外段多肽的融合蛋白，免疫雌性Balb／c小鼠后取效价较高的小鼠行小鼠脾细胞与SP2／0细胞融合，以酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫细胞化学、免疫组织化学法筛选、鉴定分泌特异性抗：PSMA膜外段的单克隆杂交瘤细胞株。结果 经过ELISA初筛得到55个阳性杂交瘤细胞株，其中8株经免疫组化证实为可用于前列腺癌石蜡包埋组织切片的免疫组化染色。结论 获得了8株可持续分泌抗PSMA膜外段单克隆抗体的杂交瘤细胞株，产生的单抗以后可用于前列腺癌的诊断，并为前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。     

大鼠抗小鼠重组膜联蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌特异性抗小鼠膜联蛋白A2（AnxA2）的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系。方法利用重组小鼠AnxA2蛋白作为抗原免疫Wistar大鼠,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠AnxA2蛋白的大鼠-小鼠融合单抗杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型,免疫印迹和流式细胞术验证所筛选的单克隆抗体的特异性。结果通过对30多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选,获得一株分泌特异性抗小鼠AnxA2的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系SZ-158,连续培养传代后染色体分析证实,Wistar大鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞稳定融合;免疫印迹和流式细胞术显示该单克隆抗体可以特异识别小鼠AnxA2重组蛋白。结论该研究所获得的大鼠-小鼠融合单克隆抗体特异性针对小鼠AnxA2蛋白,可用于AnxA2转基因小鼠中AnxA2表达的检测,为深入研究AnxA2的功能提供了物质保障。     

腺样囊性癌SACC-83细胞对雪旺氏细胞的促生长作用

目的:观察在体外共培养中腺样囊性癌细胞对由坐骨神经生长出的雪旺氏细胞的影响。方法:将腺样囊性癌细胞、舌癌细胞及成纤维细胞分别与小鼠坐骨神经共培养,制备细胞玻片并行S100免疫组化染色实验。结果:腺样囊性癌细胞可促进由坐骨神经长出的雪旺氏细胞增生;经S100免疫组化染色,阳性为雪旺细胞;阴性为成纤维细胞。结论:坐骨神经与腺样囊性癌细胞共培养可促进雪旺氏细胞增生。     

S100蛋白和GFAP在腺样囊性癌中的表达及与嗜神经侵袭的关系

目的 观察S100蛋白和GFAP在腺样囊性癌中的表达情况,探讨其与腺样囊性癌嗜神经侵袭间的关系.方法采用免疫组化方法对45例腺样囊性癌以及正常腮腺组织中的S100蛋白和GFAP进行检测.结果 45例腺样囊性癌中,有34例出现癌细胞包绕或侵袭神经现象,11例无此类现象,S100蛋白和GFAP在嗜神经现象组的阳性率分别为100%(34/34)、94.14%(32/34),在非嗜神经现象组阳性率为90.91%(10/11)、45.45%(5/11).两组间S100蛋白阳性率无明显差异(P>0.05),GFAP阳性率比较差异明显,P<0.01.结论 S100蛋白和GFAP在腺样囊性癌中均过表达,但GFAP在两组间差异明显,可能与腺样囊性癌嗜神经侵袭的关系密切.     

S-100蛋白和NSE在先天性巨结肠诊断中的协同作用

目的:探讨S-100蛋白和神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)在先天性巨结肠(HD)中的表达及其意义.方法:结合光镜下肠壁神经节细胞的形态特征,并应用免疫组化技术对25例临床及病理诊断为先天性巨结肠的病变肠段行S-100和NSE染色,比较染色结果和分布特点.结果:扩张段及狭窄段结肠壁中S-100在神经丛内的神经纤维、雪旺细胞及周围细胞均有阳性表达,NSE呈弱阳性表达;而在神经节细胞中NSE呈阳性表达,S-100则呈阴性表达.扩张段及狭窄段中神经节细胞数差异有显著性,神经纤维数差异无显著性(P＞0.05),但是前者神经纤维直径明显较后者大(P＜0.01).结论:S-100,NSE可协同互补作为HD明确诊断的重要标记物,为临床HD的正确诊断、治疗提供依据.     

SD大鼠乳鼠咀嚼肌成肌细胞的原代培养

目的 建立SD大鼠乳鼠咀嚼肌成肌细胞体外培养方法。方法 分离SD大鼠乳鼠咀嚼肌，采用胰蛋白酶和胶原酶多次消化法分离细胞，再用差速贴壁法对细胞进行纯化，所得的细胞进行Desmin免疫组化鉴定。结果 95％的培养的细胞Desmin胞浆呈阳性反应，台盼蓝检查细胞成活率超过94％。结论 多次消化和差速贴壁法可获得高产量高纯度的成肌细胞。     

人类羊膜细胞表达神经细胞和脂肪细胞表型

目的 探索羊膜组织来源的细胞向神经细胞分化的可能性，为神经移植探寻新的细胞来源。方法 采用组织块培养法培养羊膜细胞，酶消化法对细胞进行传代，应用免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定。结果 从羊膜组织成功培养出细胞，细胞贴壁生长，在体外短期内可以稳定增殖和传代，传代细胞在神经于细胞的培养基中可以形成典型的球状结构，类似神经于细胞的神经球。细胞表达波形蛋白和巢蛋白两种神经于细胞的标志物，也表达神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶和βⅢ管蛋白；大部分细胞表达多巴胺能神经元的标志物酪氨酸羟化酶。少数细胞表达星型胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白。部分细胞可以随机分化为平滑肌细胞，表达平滑肌肌动蛋白；在诱导条件下，羊膜细胞也可以分化为脂肪细胞。结论 羊膜组织来源的细胞可以表达神经细胞的标志物，能够分化为脂肪细胞和平滑肌细胞，这种细胞对于神经移植有潜在的应用前景。     

雪旺细胞标志物GFAP在涎腺腺样囊性癌中的表达意义

目的 :研究雪旺细胞标志物神经细丝酸性蛋白(GFAP)在腺样囊性癌及粘液表皮样癌中的表达 ,探讨其与腺样囊性癌嗜神经侵袭间的关系 .方法 :选取 2 0例腺样囊性癌 ,1 8例粘液表皮样癌以及 2例正常腮腺组织标本 ,进行GFAP免疫组化染色 .结果 :2 0例腺样囊性癌中有 1 8例发现神经受侵现象 ,1 8例粘液表皮样癌只有 2例发现神经受侵现象 ,经 χ2 检验 ,两者有显著性差异 (P <0 .0 1 ) .GFAP在 1 8例腺样囊性癌中有表达 ,而在粘液表皮样癌中则全部没有表达 ,经 χ2 检验 ,两者有显著性差异 (P <0 .0 1 ) .结论 :腺样囊性癌细胞发生了雪旺分化进而侵袭神经可能是腺样囊性癌嗜神经侵袭的组织学基础     

成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养与鉴定

目的 探索一种简便、经济实用的获得成年大鼠嗅鞘细胞的方法.方法 无菌条件下取2.5月龄的SD大鼠嗅球最外二层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养.定期进行形态学观察并摄片.在培养第14 d行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度.结果 培养的嗅鞘细胞呈双极、多突起形、扁圆形三种,其中扁圆形较少,嗅鞘细胞的纯度在90%以上.结论 差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠嗅鞘细胞原代培养是一种简便经济实用的方法,可获得高纯度的嗅鞘细胞.     

人骨髓间充质干细胞与汗腺细胞共同培养诱导细胞表型转化的初步研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)在体外与损伤的人汗腺细胞(human sweat gland cells, hSGCs)共培养时的转化情况.方法体外分别分离培养和扩增hMSCs和hSGCs,用二步免疫细胞化学法检测hMSCs和hSGCs抗原表达情况.用5 μmol/L的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)对培养的hMSCs进行连续培养标记.待原代培养的hSGCs达70%融合后,给予47℃高温处理40 min造成热损伤体外模型,37℃冷却1-2 h,然后加入(1-2)×105 BrdU标记的hMSCs共同培养,2周后,以抗癌胚抗原(CEA)和抗BrdU单克隆抗体作为一抗,采用免疫细胞化学双染法检测共培养的细胞.结果 hMSCs 和hSGCs均呈克隆样生长, hMSCs表达CD44和CD105,不表达CD34和CEA;hSGCs表达CK7、CK8、CK19、CEA.用BrdU 标记hMSCs 阳性率可达90%,hSGCs经高温损伤后,大多数细胞的细胞间连接消失.共培养2周后,部分细胞同时表达CEA和BrdU,并有多核现象.细胞染色示双染细胞可达1%～5%,多核细胞且核染色不同的细胞约为0.01%～0.05%,多核细胞与其他双染细胞相比,细胞明显的宽大扁平.结论在损伤的微环境下,hMSCs可以向hSGCs转化,其机制可能是细胞分化、细胞融合甚至是核融合.     

Anti-Fas antibody induces apoptosis in cultured human renal interstitial fibroblasts

Objective To detect if Fas is expressed in human renal interstitial fibroblasts (hRIFs) an d apoptosis of hRIFs can be induced by specific anti-Fas antibody.Methods hRIFs were cultured from isolated papillae of human kidney, and identified by mo rphologic examination, assay of antigenic components and culture in D-valine se lective medium.Fas expression in normal hRIFs was detected by RT-PCR and imm unocytochemistry staining.After hRIFs were incubated with interferon gamma (γ -IFN 500 U/ml, 1000 U/ml, 1500 U/ml and 2000 U/ml, respectively) for 48 hou rs, Fas expression was determined by Northern blot, Western blot and flow cytome try.hRIFs pre-stimulated with γ-IFN (500 U/ml, 48 hours) were incubated wi th anti-Fas antibody (IgM, 0.5 μg/ml) for 12 hours.And apoptosis was ident ified by morphologic examination, DNA ladder assay and flow cytometry. Results The cultured hRIFs showed a shuttle-like shape and were positively stained by l abeled anti-vimentin antibody but negatively stained by anti-epithelial membra ne antibody.They could not grow in the D-valine selective medium and died par tly in a week.Fas mRNA and protein were expressed in normal hRIFs and markedly upregulated by stimulation with γ-IFN.Apoptosis in γ-IFN pre-stimula ted hRIFs was induced by anti-Fas antibody, showing cell nuclear shrinkage and condensation in morphologic feature, internucleosomal DNA fragmentation in DNA l adder assay and a pick of hypo-diploid nuclei by flow cytometry.Conclusion Fas is normally expressed in hRIFs and can be markedly upregulated by γ-IFN. Anti-Fas antibodies can induce apoptosis of hRIFs pre-stimulated with γ-IF N.     

二氧化硅引起巨噬细胞形态学变化和肿瘤坏死因子的表达

目的:研究不同浓度二氧化硅(SiO2)是否诱导培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7的形态学变化和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。方法:用不同浓度的SiO2刺激巨噬细胞后,观察其细胞的形态学改变,并用免疫细胞化学检测其TNF-α的蛋白表达。结果:与对照组相比SiO2浓度为25μg/mL时,巨噬细胞形态和TNF-α蛋白表达无明显改变(F=229.99,P>0.05);随着SiO2浓度的增加(50～100μg/mL)巨噬细胞外形略显不规则,但仍不明显,而TNF-α蛋白表达则明显增加(P<0.01);当SiO2浓度为150μg/mL时,细胞形态改变明显,表现为细胞突起变长,数量明显减少,胞质内颗粒增多,部分细胞开始崩解,且TNF-α蛋白表达亦明显增加(P<0.01)。结论:巨噬细胞分泌的TNF-α在硅肺的发生中可能起重要作用。