Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

目的：探讨Tob1对肾上腺皮质癌细胞自噬的作用及其影响。方法：将体外培养的SW-13细胞分为对照组、空载质粒转染组以及pcDNA3.1-Tob1质粒转染组。实时荧光定量PCR检测各组细胞中Tob1的mRNA表达。Western blot检测Tob1以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin 1的表达。LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。随后在转染pcDNA3.1-Tob1质粒的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理,CCK-8检测细胞增殖,Tunel检测细胞凋亡。结果：pcDNA3.1-Tob1质粒转染显著上调SW-13细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达,提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1水平,降低p62蛋白表达,并显著提升细胞自噬水平(P<0.05)。与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组SW-13细胞增殖降低,细胞凋亡增加;与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖提升,细胞凋亡降低(P<0.05)。结论：Tob1能够通过激活细胞自噬降低人皮质癌细胞SW-13增殖并促进其凋亡。     

HIF-2琢对自噬介导的肝癌细胞顺铂耐药的影响及机制

目的探究低氧诱导因子-2琢（HIF-2琢）对自噬介导的人肝癌阿霉素耐药细胞株（HepG2/ADM）顺铂（cisplatin）耐药的影响及机制,以期为疾病的临床治疗提供新思路。方法将人肝癌细胞HepG2和HepG2/ADM分为7组并加入相应试剂：（1）HIF-2琢-siRNA＋cisplatin组;（2）HIF-2琢-siRNA组;（3）NC-siRNA组;（4）3-甲基腺嘌呤（3-MA）＋cisplatin组;（5）cisplatin组;（6）3-MA组;（7）对照组。采用Westernblot法检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin1、HIF-2琢蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率,CCK-8试剂盒检测细胞增殖抑制率。结果cisplatin组HepG2、HepG2/ADM细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、HIF-2α蛋白表达水平及细胞凋亡率较对照组均显著升高（均P＜0.05）。3-MA组HepG2/ADM细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平较对照组均显著下降（均P＜0.05）。3-MA＋cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较cisplatin组、3-MA组和对照组均显著升高（均P＜0.05）;cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较3-MA组和对照组均显著升高（均P＜0.05）。HIF-2琢-siRNA组HepG2/ADM细胞中HIF-2琢、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平较NC-siRNA组均显著下降（均P＜0.05）。HIF-2琢-siRNA＋cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较HIF-2琢-siRNA组、NC-siRNA组和cisplatin组均显著升高（均P＜0.05）;HIF-2琢-siRNA组和NC-siRNA组HepG2/ADM细胞凋亡率较cisplatin组均显著降低（均P＜0.05）。沉默HIF-2琢表达后,随cisplatin处理浓度增加,HepG2/ADM细胞增殖抑制率升高。结论HIF-2琢可能通过调节自噬影响肝癌细胞HepG2/ADM的cisplatin耐药性,因此临床上可通过降低HIF-2α表达水平,提高cisplatin对肝癌细胞HepG2/ADM的杀伤作用,为晚期肝癌治疗提供新思路。     

APE1乙酰化调节电离辐射诱导的HeLa细胞自噬

目的 探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)乙酰化对电离辐射诱导HeLa细胞自噬的调节作用.方法 给予Elekta precise直线加速器处理HeLa细胞及子系细胞APE1wT和APE1 K6R/KTR,应用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)的方法检测APE1乙酰化修饰及Beclin1/Bcl2的结合,流式细胞仪检测细胞自噬的水平,免疫荧光激光共聚焦检测LC3的聚集,Western blot检测APE1、LC3和p62的表达.结果 HeLa细胞APE1乙酰化水平随着照射剂量的增加和照射后时间的延长而逐渐升高(P＜0.05).HeLa细胞LC3Ⅱ的表达与照射剂量呈正相关,而与p62呈负相关(P＜0.05);电离辐射促进细胞的自噬水平和LC3的聚集.电离辐射后,LC3Ⅱ上调;与对照组APE1wT相比,APE1 K6R/K7R细胞Beclin1/Bcl2结合增强,LC3Ⅱ/LC3 I比值降低,p62表达上调(P＜0.05).结论 APE1乙酰化通过Beclin1/Bcl2途径调节电离辐射诱导的HeLa细胞自噬.     

褪黑素通过激活自噬抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长和转移

目的 探讨褪黑素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和转移的作用及其机制。方法 将MDA-MB-231细胞设置对照组以及1、3、5 mmol/L褪黑素处理组,Western blot检测自噬对细胞生长、转移的影响时,添加3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合褪黑素组。使用不同浓度褪黑素处理MDA-MB-231乳腺癌细胞24、48 h,并加入0.1%无水乙醇的细胞作为对照,CCK-8法检测细胞增殖活性确定最佳处理浓度和时间,筛选出3 mmol/L褪黑素用于后续实验。集落形成实验及划痕实验检测不同浓度褪黑素对乳腺癌细胞集落形成能力和迁移能力的影响;流式细胞术、免疫荧光检测3 mmol/L褪黑素对MDA-MB-231细胞凋亡率和自噬蛋白阳性着色情况;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl2、Bax,上皮-间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、Snai1的水平。结果 CCK-8结果显示,与对照组相比,褪黑素呈浓度及时间依赖性抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.05）;集落形成实验显示,3个浓度褪黑素处理组的集落数低于对照组;褪黑素作用24 h后明显抑制乳腺癌细胞划痕愈合速度（P<0.01）,并诱导细胞凋亡率增加（P<0.01）;且与对照组相比,褪黑素组的促凋亡蛋白Bax表达增加（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl2表达下调（P<0.05）,Bcl2/Bax的比值逐渐减低（P<0.01）;转录因子Snail减少,上皮细胞标志蛋白E-cadherin增加;单独使用褪黑素能够诱导细胞内自噬标记蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1表达增加,P62表达减少（P<0.05）以及Beclin1蛋白阳性着色增强,P62蛋白阳性着色减弱;3-MA+褪黑素组中自噬相关蛋白Beclin1（P<0.001）、LC3-ΙΙ/LC3-（Ι P<0.05）以及凋亡蛋白Bax（P<0.01）、上皮细胞标志蛋白E-cadherin（P<0.001）明显低于褪黑素组,抗凋亡蛋白Bcl2（P<0.05）、转录因子Snail以及Bcl2/Bax的比值（P<0.01）高于褪黑素组。 结论 褪黑素可通过诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞发生自噬,抑制乳腺癌细胞增殖、转移并促进其凋亡,而减少自噬,可减弱褪黑素对乳腺癌细胞生长和转移的抑制作用。     

白细胞介素6通过抑制自噬促进人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：探讨IL-6对血管内皮细胞自噬和凋亡的影响以及自噬与凋亡的相互作用关系。方法：采用不同浓度IL-6诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖与活性,流式细胞术检测细胞凋亡变化,单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色观察细胞嗜酸性自噬泡情况,透射电镜观察细胞超微结构的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白激活型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase3)以及自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和(sequestosome 1, SQSTM1)/P62表达水平。进一步采用IL-6分别联合自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RP)诱导自噬或3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬,观察自噬对IL-6诱导血管内皮细胞凋亡的影响。结果：1. 与对照组相比,IL-6可以呈浓度依赖性降低血管内皮细胞的活性(P＜0.05),增加血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);2. IL-6浓度依赖性降低血管内皮细胞内LC3-II/LC3-I的表达(P＜0.05)而增加P62的表达(P＜0.05),在IL-6刺激下,MDC 染色观察可见血管内皮细胞内自噬泡逐渐减少(P＜0.05),荧光强度明显减弱,透射电镜下表现为自噬小体明显减少;3. 采用自噬抑制剂3-MA刺激血管内皮细胞,发现3-MA可以进一步抑制IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而增加凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达进一步下降(P＜0.05)和P62的表达进一步增加(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量明显减少(P＜0.05),并且3-MA可以进一步增加IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);4. 进一步采用自噬促进剂RP刺激血管内皮细胞,发现RP可以改善IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而降低凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达升高(P＜0.05)和P62的表达下降(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量的增多(P＜0.05),并且RP可以明显减少IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05)。结论：白介素-6可通过抑制自噬而增加血管内皮细胞凋亡。     

异钩藤碱通过mTOR非依赖性途径诱导SH-SY5Y细胞自噬发生

目的探讨异钩藤碱(Isorhynchophylline,IRN)人胶质瘤细胞SH-SY5Y细胞自噬的发生及其与mTOR信号通路的关系。方法用不同浓度IRN(6、12和24μmol/L)处理SH-SY5Y细胞24 h,免疫印迹法检测自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ的表达,免疫荧光法观察微管相关蛋白轻链3(LC3)荧光斑点标记的自噬体形成,利用溶酶体稳定剂氯喹(CQ)以及自噬抑制剂3-MA进一步明确IRN作用的途径。Western蛋白印迹法检测mTOR相关蛋白和Beclin1的表达。结果 IRN作用SH-SY5Y细胞24 h后,可显著上调LC3-Ⅱ表达,0、6、12、24μM IRN作用后的相对表达量分别为(0.086±0.02)、(0.39±0.14)、(0.96±0.09)、(1.93±0.14)。自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高(P0.01),并呈浓度依赖性,SH-SY5Y细胞内GFP-LC3荧光斑点标记的自噬体增多,在IRN不同浓度处理组(0、6、12、24μM)中分别为2±1/细胞,4±1/细胞,8±1/细胞,和14±2/细胞。IRN联合CQ后可以促进LC3-Ⅱ的表达(0.64±0.052)。IRN可以削弱a-Syn蛋白表达,在0、6、12、24μM组中的相对表达量为(0.71±0.07)、(0.69±0.05)、(0.53±0.04)、(0.36±0.034),并呈浓度依赖性,联合3-MA后a-Syn表达上调(0.63±0.04),提示3-MA可以逆转由IRN对a-Syn的抑制效果,而CQ对a-Syn表达,与对照组比无显著影响。信号通路研究提示,对mTOR以及Beclin1表达不影响,Beclin1特异性si RNA作用后可以抑制IRN诱导的LC3-Ⅱ表达。结论 IRN可诱导SHSY5Y细胞自噬的发生,其机制为mTOR非依赖性自噬途径,Beclin1的表达可以影响IRN诱导的自噬。     

细胞自噬在三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究

【摘要】 目的 研究细胞自噬在三氧化二砷（ATO）诱导的肝癌细胞死亡中的作用,观察调控细胞自噬对ATO诱导的细胞凋亡有何影响。方法 以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在ATO作用于HepG2细胞的基础上,加入自噬激动剂〔雷帕霉素（Rap）〕和自噬抑制剂〔三甲基腺嘌呤（3-MA）〕进行调控。以MTT法检测细胞生存率,透射电镜观察自噬体结构,免疫印迹法分析自噬相关蛋白LC-3和Beclin1的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 5~20 μmol/L ATO与10 mmol/L 3-MA联用时HepG2细胞存活率比同剂量ATO单独作用时降低（P <0.05）,凋亡率增加（P <0.05）,细胞内呈现典型凋亡反应特征,自噬蛋白LC3和Beclin1表达低于ATO单独作用组（P <0.05）。相反,5~20 μmol/L ATO与0.25 μmol/L Rap联用时,HepG2细胞的存活率比ATO单独作用时显著增加（P <0.05）,凋亡率降低（P <0.05）,细胞内出现大量自噬体结构,自噬蛋白LC3和Beclin1的表达较ATO单独作用组有增加趋势,但差异无统计学意义（P >0.05）。结论 特异性自噬抑制剂能显著增强ATO杀伤肝癌细胞的敏感性,其机制与增强肝癌细胞凋亡有关。     

IL-33增强胃癌细胞顺铂抵抗的机制研究

目的研究IL-33对胃癌细胞自噬调节的作用,分析其对胃癌细胞的作用靶标,阐明胃癌细胞顺铂耐药的作用机制。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定不同剂量IL-33处理下,胃癌细胞MKN45和正常胃上皮细胞GES-1的增殖率、胃癌细胞对4种化疗药物的敏感性及胃癌细胞对顺铂及其抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）的敏感性。Westernblot法检测IL-33作用下,胃癌细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3α/β（LC3A/B）、Beclin1和生长刺激表达基因2蛋白（ST2）相对表达量的变化。结果高剂量IL-33促进胃癌细胞增殖。≥128ng/LIL-33处理后,胃癌细胞对顺铂产生显著抵抗作用,顺铂共培养的胃癌细胞增殖率显著上升（P＜0.05）。IL-33作用下胃癌细胞自噬相关蛋白LC3A/B和Beclin1相对表达量提高（P＜0.05）,3-MA逆转了IL-33对胃癌细胞的顺铂耐药效应（P＜0.05）。添加iST2-1,IL-33处理下的胃癌细胞自噬相关蛋白相对表达量上调,顺铂共培养的胃癌细胞增殖率降低（P＜0.05）。结论IL-33能够通过与ST2结合介导胃癌细胞自噬水平增加,进而产生对顺铂的耐药性。     

3-甲基腺嘌呤诱发HeLa细胞自噬及抑制辐照细胞自噬的双重作用

目的了解PI,K抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对电离辐射后细胞自噬的影响,初步探讨作用机制。方法细胞增殖-毒性试剂盒CCK-8检测不同浓度3-MA处理及60Coγ射线4Gy照射或联合3-MA作用的HeLa细胞细胞生长变化和毒性,Annexin V—FITC／PI双标记检测细胞凋亡,Westernblot检测自噬相关蛋白SQSTMl／p62表达,Lipofectamine2000介导转染GFP—LC3质粒,共聚焦显微镜检测自噬体形成。结果3mmol／L以上浓度3-MA作用24h对HeLa细胞增殖有明显的抑制作用,作用更长时间产生致死毒性效应。无论是5mmol／L3-MA单独作用还是单独4Gy照射,均能诱发HeLa细胞自噬。但3-MA与（射线辐照联合作用时,HeLa细胞自噬受到抑制,细胞凋亡显著增加。结论PI3K抑制剂3-MA既诱发细胞自噬又能抑制电离辐射诱发细胞自噬,以在不同的条件下两种方式影响细胞存活。     

小鼠骨髓间充质干细胞自噬与衰老的关系

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）自噬与衰老的关系。方法 通过体外分离培 养年轻组小鼠（8 周龄）和老年组小鼠（18 个月龄）BM-MSCs,流式细胞术检测细胞表型,TUNEL 染色检 测细胞凋亡,ELISA 试剂盒检测BM-MSCs 分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF 的表达,Western blot 检 测自噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62 及信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、 mTOR 的表达。结果 与年轻组比较,老年组BM-MSCs 凋亡增加（P <0.05）,分泌功能下降（P <0.05）,自 噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5 表达水平下降（P <0.05）,相反p62 蛋白表达水平升高 （P <0.05）,自噬信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 表达升高。结论 老年小鼠BM-MSCs 凋亡增加,自噬活性及旁分泌功能下降。     

黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡

目的研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组。除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理。用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P0.05)。与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P0.05)。结论黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。     

姜黄素对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡及衰老的影响

目的 探讨姜黄素对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬、凋亡及衰老的影响.方法 体外培养HUVECs,分为对照组(只给予培养基),模型组(给予60 μmol/L H2O2),姜黄素组(给予60μmol/L H2O2+ 10 μmol/L姜黄素),3-MA组[(给予60 μmol/L H2O2+ 10μmol/L姜黄素+1 mmol/L3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine)],培养4d后,DCFH-DA法检测细胞培养液中活性氧(ROS)的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老程度,Western blot技术检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达水平.结果 与对照组相比,模型组ROS含量、凋亡率、SA-β-gal阳性率及p62水平升高(均P＜0.05),而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值差异无统计学意义(P＞0.05).与模型组比,姜黄素组ROS含量、凋亡率及SA-β-gal阳性率及p62水平降低(均P＜0.05),但LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高(P＜0.05).与姜黄素组比较,3-MA组ROS含量、凋亡率、SA-β-gal阳性率及p62水平升高(均P＜0.05),但LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P＜0.05).结论 姜黄素可减轻H2O2诱导内皮细胞凋亡及衰老,其机制与提高内皮细胞自噬有关.     

丝胶蛋白通过自噬通路调控人胃癌MKN45细胞的增殖

目的探索丝胶蛋白对胃癌MKN45细胞增殖活性的影响及作用机制。方法用LC3双荧光自噬病毒转染胃癌MKN45细 胞,用嘌呤霉素筛选LC3双荧光自噬病毒的MKN45稳转株。实验分为3组,空白对照组（Blank）、丝胶蛋白阳性组（Sericin）、丝 胶蛋白加自噬抑制剂组（Sericin+3-MA）。培育48 h后用cck-8试剂测定细胞增殖活性,根据所测数据得出丝胶蛋白半数致死浓 度IC50,按此浓度处理细胞并培育48h,用流式细胞仪分别检测凋亡、周期,电镜检测细胞自噬,Western blotting检测LC3、p62、 Beclin蛋白表达。将种植胃癌的裸鼠分为2组,即对照组（Saline）、丝胶蛋白阳性组（Sericin）,每组5只;分别注射生理盐水和丝 胶蛋白,测量肿瘤体积和质量。结果丝胶蛋白阳性组（Sericin）与空白对照组（Blank）相比,MKN45细胞增殖活性明显受到抑 制,且细胞凋亡增加（P<0.01）,细胞阻滞于G2/M期（P<0.01）。相对于空白组,丝胶蛋白处理后细胞在电镜观察到自噬小体明显 增多;Western blotting检测到LC3-2 表达上调,Beclin表达增加,p62表达逐渐下调;丝胶蛋白加自噬抑制剂组（Sericin+3-MA） 实验结果则介于两者之间。动物实验中,丝胶蛋白阳性组（Sericin）与对照组（Saline）相比,肿瘤体积和质量有显著下降。结论 丝胶蛋白可通过调控胃癌MKN45细胞自噬影响细胞增殖活性。     

Beclin1基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用

目的 探讨Beclinl基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用.方法 采用RNA干扰技术抑制Beclinl表达,Beclinl被抑制后细胞的存活能力通过MTT实验评估;结直肠癌细胞SW620在血清剥夺状态下自噬活性通过LC3蛋白水平评估;分别经血清剥夺、星孢菌素及依托泊苷处理的SW620凋亡率通过流式细胞仪检测;Beclinl表达情况经Western blot评估.结果 pSUPER-Becl组细胞血清剥夺后存活能力显著降低(P＜0.05),在血清剥夺24 h后,空白对照组和pSUPER-non组抗凋亡能力比pSUPER-Becl组更强(P＜0.05),星孢菌素处理后,pSUPER-Becl组细胞凋亡最为显著(P＜0.05),用依托泊苷处理后得到相似的结果(P＜0.05);pSUPER-non组与空白对照组细胞中Beclinl的表达随血清剥夺时间的延长呈现上调趋势(P＜0.05),这与LC3的表达变化相一致;而pSUPER-Becl组LC3的表达显著减少(P＜0.05).结论 Beclin1是结直肠癌细胞中自噬和凋亡的关键调节因素,并且维持凋亡和自噬的平衡;Beclinl通过调节细胞自噬活性,在结直肠癌发展与演进中作为一种保护机制,使肿瘤细胞免受到低营养和化疗所致的损伤而持续生存.     

AKT抑制剂对鼻咽癌细胞株CNE1的放疗增敏作用

【目的】 探讨Akt抑制剂124005对人鼻咽癌细胞CNE1放射增敏效应及其潜在机制。【方法】 CCK8法检测不同浓度124005对人鼻咽癌CNE1细胞的抑制作用,计算IC50值,选择低于IC50的药物浓度作为增敏浓度,集落形成实验检测放射线加或不加124005以及124005+放射线组联合或不联合自噬抑制剂3-MA对CNE1细胞生存曲线的影响,间接免疫荧光法检测γ-H2AX观察DNA损伤修复和GFP-LC3转染CNE1中自噬标志物LC3的聚集,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡、免疫印迹法(Western blot)检测Caspase-3、PARP、Beclin 1和LC3-Ⅱ的表达,并检测AKT及下游信号通路的表达,探索Akt抑制剂124005放射增敏效应及其潜在机制。【结果】 124005对CNE1 IC50值为30.5 μmol/L。集落形成实验显示,DEF值放疗+8 μmol/L 124005持续用药组为1.92,放疗+12.5 μmol/L 124005用药72 h组为1.12,共聚焦显微镜观察显示124005联合放疗显著增加了CNE1细胞照射后细胞核内γ-H2AX焦点的聚集和转染GFP-LC3质粒的CNE1细胞内LC3的点状聚集、流式检测124005可以明显提高放射线诱导的CNE1细胞凋亡,凋亡率最高达52.9%。Western blot显示124005可以显著抑制放射后p-AKT及下游p-GSK-3?茁和p-PRAS40的表达,增加放射引起的cleaved caspase-3和cleaved PARP以及Beclin 1和LC3-Ⅱ的表达,应用3-MA可降低124005处理后LC3-Ⅱ的表达水平?放射+124005再联用3 mmol/L 3-MA组的DEF值为1.69,明显低于单纯放射+124005组(DEF=1.97)。 【结论】 124005通过对AKT以及下游通路的抑制,抑制DNA损伤修复,同时增加凋亡和自噬来起到对CNE1细胞株放射增敏的效应。     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤增强鼻咽癌细胞对放射和化学治疗的敏感性

目的：探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)增强鼻咽癌细胞对放射治疗(放疗)和化学治疗(化疗)敏感性的作用及其相关的分子机制。方法：采用MTT法检测3-MA对细胞的增殖抑制作用;集落克隆形成法检测3-MA对细胞集落克隆形成的影响;Annexin V/PI双染法、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、DAPI染色检测细胞凋亡;Western 印迹检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、自噬相关蛋白beclin1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)表达。结果：不同体积浓度或剂量的顺铂(cisplatin,DDP)、电离辐射(ionizing radiation,IR)、衣霉素(tunicamycin,TM)、3-MA对鼻咽癌细胞HONE-1均具有增殖抑制作用,且随着体积浓度或剂量的增加和作用时间的延长,对HONE-1细胞增殖抑制作用随之增加。经1.00mmol/L 3-MA预处理细胞后,再次给予6.00 μmol/L DDP,4.00 Gy IR,1.00 μmol/L TM处理,细胞存活率明显降低,均低于单用组,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。3-MA增强DDP,IR,TM抑制细胞集落克隆形成作用。用6.00 μmol/L DDP或4.00 Gy IR处理HONE-1细胞24 h后,细胞凋亡率分别为5.8%和6.7%,与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。JC-1和DAPI染色显示3-MA增强DDP,IR或TM诱导的细胞凋亡作用;Western 印迹结果显示DDP,IR或TM处理组GRP78,beclin1表达呈时间依赖性上调,LC3 I向LC3 II转化,3-MA预处理组beclin1表达明显降低,LC3 I向LC3 II的转化。结论：自噬抑制剂3-MA可增强鼻咽癌细胞对放化疗的敏感性,其机制可能与3-MA抑制内质网应激诱导的自噬所产生的保护作用相关。     

自噬对氧化低密度脂蛋白损伤内皮细胞的保护作用

目的 探讨自噬对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的作用.方法 将培养的HUVEC分为正常对照组,ox-LDL组,ox-LDL加雷帕霉素组和ox-LDL加3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,分别收集细胞和上清,其细胞用免疫印迹技术检查自噬标记蛋白LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的变化,四氮唑蓝(MTT)法和流式细胞技术检测细胞的增殖及凋亡;上清用于检测乳酸脱氢酶(LDH)活力和内皮素-1(ET-1)的含量.结果 ox-LDL作用能上调HUVEC的LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ表达(P＜0.01),增加培养上清中LDH活力(P＜0.01)及ET-1含量(P＜0.05),诱导细胞发生增殖(P=0.028)、凋亡(P＜0.05).雷帕霉素能增加ox-LDL诱导的自噬水平上调,减少其培养上清中LDH活力及ET-1含量的增加(P＜0.05),抑制ox-LDL诱导的细胞增殖.相反,3-MA在下调ox-LDL诱导自噬水平(P＜0.01)的同时,会增加细胞的凋亡及死亡.结论 ox-LDL能通过增加HUVEC LDH漏出率及ET-1分泌水平,促进细胞增殖、凋亡,对内皮细胞产生损伤作用,上调自噬能够减少这种损伤,从而对细胞起到保护作用,反之亦然.     

心肌细胞肥大中番茄红素对自噬的作用

目的 探讨在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌肥大中,番茄红素对自噬的影响.方法 原代培养的乳鼠心肌细胞,采用AngⅡ干预建立心肌肥大的模型;用番茄红素和自噬的阻断剂3-甲基腺嘌呤（3MA）干预.在光学显微镜下观察心肌细胞的形态;采用Western blot法检测自噬相关基因6（Atg6）Beclin1及自噬相关基因8（Atg8）LC3蛋白的表达;Real time PCR技术检测心肌细胞肥大标志物心房利钠多肽（ANP）的mRNA表达.结果 在AngⅡ诱导的心肌肥大中[细胞面积（517.19±52.31）;ANP相对含量（17.83±2.07）],番茄红素[细胞面积（355.82±40.45）;ANP相对含量（12.16±1.41）]缓解了心肌细胞面积的增加（F=56.518,P＜0.05）,下调了ANP的mRNA表达水平（F=157.048,P＜ 0.05）.番茄红素增加了心肌肥大时自噬相关基因Beclin1[蛋白相对含量（0.685±0.058）,F=202.873,P＜0.05]和LC3蛋白相对含量[（0.608±0.045）,F=177.114,P＜0.05]蛋白的表达.自噬阻断剂3MA降低了番茄红素对心肌细胞肥大的抑制作用（P＜0.01）.结论 番茄红素可能通过激活自噬来抑制心肌细胞肥大.