改良碱裂解法和煮沸法提取金黄色葡萄球菌DNA效果的比较

目的: 建立一种简便经济的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法。方法: 选取10株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,预先以终浓度2 mg/mL溶菌酶处理6 h,再以改良碱裂解法提取细菌基因组DNA。同时以常规煮沸法制备上述细菌基因组DNA。采用PCR法扩增两种模板中金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和femB基因,比较两种方法提取DNA的效果。结果： 以改良碱裂解法制备DNA为模板,所有10株标本均可扩增出spa基因和mecA基因,4个标本扩增出femB基因;以直接煮沸法制备DNA为模板,仅1个标本扩增出spa基因,2个标本扩增出mecA基因,所有标本未扩增出femB基因。 结论： 改良碱裂解法提取基因组DNA效果优于直接煮沸法,所提取基因组DNA可以满足PCR扩增的要求。     

三种方法提取金黄色葡萄球菌DNA的比较

目的对三种金黄色葡萄球菌DNA提取方法的效果进行比较,以期获得一种简便、经济的提取方法。方法采用改良SDS法、NP40法和细菌DNA试剂盒法分别提取同一浓度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,利用Nano Drop 2000核酸检测仪测定核酸浓度和纯度,纯度用核酸在波长260 nm处的吸光值与在波长280 nm处的吸光值的比值A260/A280表示,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量;提取不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,PCR扩增16S r DNA片段检测并比较三种方法的灵敏度。结果三种方法提取金黄色葡萄球菌所得核酸浓度差异有统计学意义(χ~2=6.25,P0.05),NP40法提取浓度较高,改良SDS法较低。试剂盒法提取的DNA纯度较高,A_(260)/A_(280)值在1.8~2.0之间;NP40法提取纯度较差;DNA电泳结果表明SDS法和TIANGEN试剂盒法提取的DNA条带清晰,无拖带现象,NP40法未出现DNA主带,且有拖带现象。所有方法所得DNA经PCR扩增均出现阳性条带。NP40法提取DNA的PCR检测敏感度最高,为1.5×10~6 cfu/ml,改良SDS法敏感度最低,为1.5×10~8 cfu/ml。结论 NP40法提取DNA成本低,耗时少,灵敏度高,适用于金黄色葡萄球菌的快速初筛。     

金黄色葡萄球菌抗生素耐药质粒DNA的抽提及检测

本文报道了用溶菌酶合并使用少量溶葡萄菌素作为破壁酶提取金黄色葡萄球菌质粒DNA,然后用琼脂糖凝胶电泳来检测的方法。比较研究了一株自南京地区分离的金黄色葡萄球菌多剂耐药株(22)及用大黄素处理后所得的不同耐药性消除菌株的质粒DNA。结果证明,在金黄色葡萄球菌(22)中含有4条质粒带。分子量较小的二条质粒带可能与四环素耐药性及青霉素耐药性有关。它们的分子量约为2.6及2.0 Mdal。     

3种方法对临床菌血症样本细菌DNA提取的比较

目的寻找一种简单、有效的提取临床菌血症样本细菌DNA的方法．方法分别用碱液加热裂解法、溶菌酶法和商品DNA提取液法提取细菌DNA,用临床常见病原菌特异性引物,进行PCR扩增．结果（1）商品DNA提取液法提取革兰阴性菌DNA,经PCR扩增后得到特异性目的片段,但未扩增出革兰阳性菌的特异性目的片段;（2）碱液加热裂解法、溶菌酶法提取革兰阴、阳性菌DNA,经PCR扩增后均得到特异性目的片段,但碱液加热裂解法比溶菌酶法能扩增到更低浓度的细菌DNA目的片段．结论碱液加热裂解法是3种方法中最简单有效的细菌DNA提取方法,适用于临床病原菌基因组DNA提取．     

用溶菌酶—SDS微量法提取金黄色葡萄球菌质粒DNA

本文报道了检测金黄色葡萄球菌质粒DNA的微量方法(溶菌酶-SDS微量法),无需使用溶葡萄球菌素(Lyostaphin)。方法用少量的斜面培养物,经溶菌酶、SDS、EDTA裂解细胞,碱酚和氯仿-异戊醇一次脱蛋白,乙醇沉淀DNA,便得到可以直接用于琼脂糖凝胶电泳检测的质粒DNA。将该法与常规的溶葡萄球菌素法进行比较,分别检测了30株从南京地区临床分离的耐药性金黄色葡萄球菌。两种方法对细胞的裂解率为100%,质粒检出率为96.6%。用两种方法所得到的质粒电泳图谱基本相同,有些菌株发现有大质粒带。     

细菌性感染性腹泻常见病原菌的多重PCR检测

目的:建立一种能同时检测细菌性感染性腹泻标本中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法:根据沙门菌的invA基因序列、志贺菌的ipaH基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列、副溶血性弧菌的tdh基因序列设计特异性引物,通过多重PCR反应对样品中上述4种病原茵的目标基因进行扩增,同时优化反应体系。结果:本方法的特异性和灵敏性良好,该方法能检测的灵敏度分别为103.56pg的沙门菌DNA,94.85pg的志贺菌DNA,14.1pg的金黄色葡萄球菌DNA,115.32pg的副溶血性弧菌DNA。结论:该方法特异性和灵敏度高,检测周期短,适用于细菌性感染性腹泻标本中多种致病菌的快速检测,具有较好的应用前景。     

拭子提取黏膜部细菌DNA方法的优化

目的:探索一种适合于黏膜部微生物组学分析的DNA抽提方法.方法:评价玻璃珠机械破碎法+溶菌酶裂解法结合DNA提取试剂盒法(Beads+ Lysozyme+ QIA法)和溶菌酶裂解法结合DNA提取试剂盒法(Lysozyme+ QIA法)对9例鼻咽拭子和5株常见细菌的DNA提取效果.利用NanoDrop 2000测定DNA的浓度;以末端限制性片段长度多样性(T-RFLP)分析DNA的生态结构多态性.结果:两种方法对鼻咽拭子总DNA提取量无明显差别(P=0.288);T-RFLP结果显示,Beads+Lysozyme+ QIA法可得到92种末段限制性片段(T-RF),高于Lysozyme+ QIA法所得的43种,Beads+ Lysozyme+ QIA法SDI为(2.34±0.43)明显高于Lysozyme+ QIA法(1.61±1.09)(P=0.03),Beads+ Lysozyme+ QIA法可以获得更丰富的T-RF;Beads+ Lysozyme+ QIA法在表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌中可获得更高的DNA提取量(均P＜0.05),在甲型溶血性链球菌和枯草芽孢杆菌中两种方法无明显差异(P＞0.05).结论:优化的拭子提取细菌DNA的方法可以更大程度地反映样本中微生物的多样性,减少偏倚;有利于黏膜部微生物组学的研究.     

混合菌基因组的合并提取及鉴定

目的为了简便、快速的提取混合病原菌的基因组DNA，进而获得不同病原菌的特异性毒力DNA片断用于进一步的基因诊断。方法改良了裂解试剂，同时提取革兰氏阳性菌(以金黄色葡萄球菌为代表)和革兰氏阴性菌(以产毒性大肠杆菌ETEC为代表)的混合基因组DNA；采用双重PCR法进行扩增鉴定。结果提取得到混合菌的混合基因组，并以此为模板通过双重PCR同时扩增得到两种菌的特异性DNA片断。结论这是一种合并提取混合菌基因组DNA，进而获得不同病原菌DNA片段的简便方法。     

战备消毒包内细菌来源分析

[目的]探讨高原地区自然环境中战备消毒包内细菌来源.[方法]根据战备消毒包内金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和人葡萄球菌筛选战备仓库空气同种细菌不同菌株,提取基因组DNA,以其为模板,对16SrRNA和23SrRNA的转录间隔区(internal transcribled spacer,ITS)序列进行PCR扩增,将扩增产物回收测序,结果用Blast进行比对.[结果]金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和人葡萄球菌DNA PCR扩增产物分别在1000 bp、1100bp、850 bp、1000 bp左右显现单一特异性条带;ITS序列相似性约为99％～100％.[结论]战备消毒包内细菌来源于空气细菌.     

多探针荧光定量PCR法用于慢性前列腺炎病原菌学诊断的建立

目的建立一种新的改良的TaqMan荧光定量PCR方法，能高度敏感地同时检测并鉴定多种细菌．该方法有一套独特的多探针设计：一对由16SrDNA基因编码的高度保守序列作为引物；引物之间的一个高度保守区域被用来设计通用探针，一个高度可变区域被用来设计特异性探针．方法通过对10种慢性前列腺炎病人细菌培养常见的病原菌的DNA提取物进行FQ-FCR（荧光定量PCR）检测，用通用探针检测这10种细菌的DNA含量，在此同时用金黄色葡萄球菌特异性探针（SA probe）和大肠杆菌特异性探针（EC probe）分别特异性检测金黄色葡萄球菌（S．aureus）和大肠杆菌（E．coil）的DNA含量．[第一段]     

LAMP与FQ—PCR技术检测HBVDNA的特异性和灵敏度比较

目的 采用环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术与实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）技术检测 HBV DNA,并对 LAMP 方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测 HBV DNA 的灵敏度及特异性。方法 选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的 HBV DNA 作为扩增模板,同时,对 LAMP 方法的各种条件进行优化,并分别采用 LAMP 和 FQ-PCR 两种方法对同一 HBV DNA 模板做 10 倍梯度稀释的标本进行 HBV DNA 的检测,比较其灵敏度;且分别用两种方法对乳头瘤病毒（HPV）、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果 对同一 HBV DNA 模板进行 10 倍梯度稀释后,FQ-PCR 技术在待测血清标本（2.38×107copy/ml）被稀释到 10-5,就难以进行准确检测了,而 LAMP 方法在待测血清标本被稀释到 10-7时,仍然能够获得较好的扩增结果;对 HPV、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 进行 LAMP 和 FQ-PCR 检测,结果均为阴性。结论 采用 LAMP方法可以成功、快速、高效、特异的扩增 HBV DNA,与 FQ-PCR 方法比较,都能特异地检测 HBV DNA,但 LAMP 方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,而且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构的推广使用。     

Thermodynamic study on antibacterial effect of different extracts from Radix Isatis

Screening of active components has been a keyproblem in modernization of traditional Chinesemedicine (TCM) .In the essence, the activity ofTCM is the intervention by active components ofTCMon metabolism of organism, which means re-ciprocal actions between TCM and organism. Thereactions ,either physical or chemical occur accom-panied with transfer of energy and change of heat .These alterations could not only be expressed bythesecondlawof thermodynamics but also be recordedby microcalori m…     

金黄色葡萄球菌L型对宫颈癌细胞生长的影响

目的:研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)L型对体外培养的单层人宫颈癌细胞(HeLa)生长的影响作用.方法:用常规方法诱导金葡菌为L型后感染HeLa细胞,采用光学显微镜、透射电子显微镜检测金葡菌L型黏附及侵入细胞情况,并采用改良的MTT比色法检测细胞增殖能力.结果:光镜、电镜检查显示金葡菌L型能够黏附并且进入HeLa细胞;改良的MTT法检测表明金葡菌L型能够促进HeLa细胞增殖(P<0.01).结论:金葡菌L型能够感染并促进HeLa细胞增殖生长,揭示金葡菌L型可能与宫颈癌的发生有关.     

金黄色葡萄球菌RAPD基因分型研究

目的了解医院内金黄色葡萄球菌RAPD基因分型,分析MRSA的流行传播情况。方法应用K-B纸片扩散法和随机多态性扩增DNA技术（Randomly amplified polymorphic DNA,RAPD）对医院分离的金黄色葡萄球菌进行MRSA鉴定和基因分型。结果 57株金黄色葡萄球菌中有MRSA31株,经RAPD扩增后,扩增产物在2~6条带之间,通过聚类分析57株菌产生10个基因型。结论Ⅵ型为本院金黄色葡萄球菌的流行优势基因型,不同来源菌株基因型分布有明显差异。RAPD分型技术简便、快速,在医院感染流行病学研究具有很大的应用前景。     

婴幼儿奶粉中病原菌多重PCR检测研究

目的建立婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法。方法根据阪崎肠杆菌外膜蛋白A（ompA）基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列，设计两对特异性引物。对反应条件进行优化，建立针对婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法，并对奶粉进行模拟检测。结果两对引物能特异扩出282bp和482bp的目的条带；在优化条件下，可同时检测模拟样品中两菌DNA，灵敏度达到10^3CFU／ml。结论与传统方法比较，研究建立的多重PCR方法敏感、特异，为快速检测奶粉中病原菌提供了有效手段。     

社区金黄色葡萄球菌感染的临床治疗对策

目的:研究社区金黄色葡萄球菌感染的临床特点和耐药情况以指导临床治疗。方法:收集2006年7月~2007年12月我院临床各类标本中分离的金黄色葡萄球菌,培养鉴定,采用纸片扩散法测定10种抗菌药物的耐药性,用WHONET5.3软件进行分析。结果:97株金黄色葡萄球菌,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为53株(54.6%);金黄色葡萄球菌对青霉素G耐药率最高(93.8%),而对万古霉素耐药率为0,除对氯霉素、利福平和复方新诺明敏感性较高外,对其它5种抗菌药物的耐药性均在50%以上。结论:社区感染的金黄色葡萄球菌存在多重耐药现象,且社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)已成为社区感染的重要问题。     

利用多重PCR检测3种食源性致病菌

目的旨在建立一种可以同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR方法。方法以金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌invA、志贺氏菌ipaH基因作为靶序列设计3对特异性引物,进行PCR反应得到223bp、302 bp、369 bp扩增片段,经测序证实扩增产物为目的片段。结果采用建立的FTA滤膜结合多重PCR的检测方法同时对这3种食源性致病菌进行检测,灵敏度均达到102 cfu/ml。结论该方法灵敏度高、耗时短,可用于同时检测3种致病菌,为预防控制细菌性食物中毒的暴发流行提供了新的检测方法。     

金黄色葡萄球菌肠毒素的检测和耐药性分析

目的了解临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)产肠毒素(SE)的情况及耐药现状。方法对从临床标本中分离出的260株SA,用反向间接血凝试验检测其肠毒素,按2005年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的标准,用K-B法对260株SA进行药物敏感性试验,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测分别用检测头孢西丁及乳胶凝集检测PBP2a方法进行。结果260株SA中有172株携带肠毒素,占66.2%,主要为SEA型10.8%(28/260)、SEB型14.6%(38/260)、SEC型10.0%(26/260),同时携带二种或二种以上肠毒素的占23.8%(62/260);其中MRSA134株,全部携带肠毒素,且以SEA、SEB和SEC为主,分别为19.4%、16.4%和13.4%;甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)126株,携带肠毒素率为30.0%(38/126),以SEB为主,占9.5%。用头孢西丁及检测PBP2a的方法检测MRSA,检出率无显著意义(P>0.05);SA对临床常用的抗菌素除万古霉素及替考拉宁较敏感(100.0%敏感),其它的抗菌素存在多重耐药性,且MRSA的耐药性比MSSA的强。结论临床分离的SA株大部分都携带肠毒素,MRSA的带毒率及耐药性均高于MSSA;临床应重视SA肠毒素和MRSA的检测,合理使用抗菌素。     

经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较

目的 比较经典酚/氯仿法和纯化试剂盒法抽提全血基因组DNA的差异.方法 分别对两种方法抽提的全血DNA产物进行紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳和体外聚合酶链锁反应（PCR）扩增.结果 两种方法DNA的提取效率相似,TaKaBa试剂盒法提取的纯度[光密度（OD）260nm/280nm]较常规酚/氯仿法明显提高.结论 TaKaBa试剂盒法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备.