表皮干细胞在成人及胎儿不同部位皮肤中的比较研究

目的 :检测表皮干细胞相对特异性分子角蛋白19(cytokeratin 19Ck19)及整合素 β1在胎儿及成人不同部位皮肤中的表达 ,以比较表皮干细胞在成人及胎儿皮肤中的差异 .方法 :免疫组化方法检测Ck19及整合素 β1,以及角朊细胞分化的特异标志分子角蛋白 10 (Ck10 )在成人及胎儿不同部位皮肤组织中的表达 ,并加以图像分析 .结果 :Ck10可见于所有标本的表皮基底层以上细胞中 ,在成人皮肤中表达层数比胎儿皮肤中多 ,且Ck10在成人皮肤及胎儿皮肤中表达差异不显著 ;Ck19在部分表皮基底层细胞及毛囊细胞中表达 ,β1整合素仅存在于基底层细胞及部分毛囊细胞 ,且胎儿皮肤中阳性细胞数目要比成人多 ,β1整合素表达阳性率在胎儿与成人皮肤中有显著差异 (P <0 .0 5 ) ;胎儿各组间比较 ,头皮组平均灰度值约为 113.9,与其他几组相比有显著性差异(P <0 .0 5 ) .结论 :表皮干细胞分布于人类皮肤的表皮基底层及部分毛囊细胞中 ,在胎儿皮肤中该细胞数量要比成人多 ,表明该类细胞随年龄逐渐减少的生物学改变 ,也反映了皮肤的生理性变化     

大鼠胚胎背部皮肤发育过程中毛囊干细胞的发育初探

目的探讨大鼠胚胎背部皮肤毛囊干细胞的发育规律。方法使用冰冻超薄切片后固定,结合免疫组织化学染色方法（IHC）,显示出毛囊干细胞的位置和发育程度,然后对医学阳性程度表达区域使用软件分析和统计方法处理。结果大鼠胚胎背部皮肤呈现逐渐增厚的趋势,其中毛囊隆突区并不明显,但可明显观察到三种干细胞标记物在皮肤全层,尤其是基底层的表达变化。结论形态学观察说明毛囊发生初期毛囊干细胞（hair follicle stem cell,HFSC）不仅仅定位于毛囊上段,三种HFSC标志物的表达有差异。背部皮肤基底层细胞具有干细胞特性,未分化为表皮细胞或者毛囊中的各种细胞。β1-integrin,CD34和K15的表达变化可能与毛囊干细胞以及毛囊的生物学特性有关。     

创面愈合过程中创缘表皮干细胞的再分布

目的：研究皮肤干细胞在全层皮肤创面愈合过程中的分布与增殖分化特征,以及该特征在创面愈合过程中的作用。方法：20只Wistar大鼠背部各制备4个面积为2．54cm^2的全层皮肤缺损创面,将创面随机分为2组,即银锌霜治疗组（40个创面）,空白对照组（40个创面）。分别于伤后3天、1周、2周和3周以组织学检查动态观察各组治疗效果,并以β1整合素、角蛋白19（K19）免疫组化法检测表皮干细胞在创面愈合过程中的分布情况。结果：两组创面愈合率在银锌霜组为80％（32／40）,对照组为60％（24／40）。两组创面肉芽组织于各时相点均未见β1整合素、K19阳性细胞出现,但于创缘表皮的棘层或颗粒层出现了散在的β1整合素和K19同时染色阳性细胞,且越接近创面这些阳性细胞更加密集,组织学上与基底层的阳性细胞无直接联系。其数量随着创面的缩小渐渐增加,直至创面愈合。创面上皮化后,这些阳性细胞逐渐减少,并随着愈合创面表皮脚的出现而消失;而感染创面的阳性细胞数量明显少于未感染创面。结论：表皮干细胞能动的参与创面的修复,创缘表皮干细胞再分布的主要功能可能是促进创面再上皮化。     

大鼠表皮基底层干细胞体外分离与培养

目的建立简单、可靠的大鼠表皮基底层干细胞体外分离培养方法。方法取新生大鼠背部皮肤,采用胰酶两步消化法获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原差速贴壁法富集干细胞,将慢黏附细胞作为对照组细胞,均以角质形成细胞无血清培养基培养。以β1-整合素和角蛋白19(K19)双重荧光染色鉴定细胞表型,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力。结果分离培养的细胞为多角形、呈铺路石样排列,倍增时间约为24h,细胞形态和生长规律符合基底层干细胞的特征。免疫荧光鉴定显示细胞共表达β1-整合素和K19,基底层干细胞克隆形成能力显著强于对照细胞。结论两步消化联合Ⅳ型胶原差速贴壁法获取基底层干细胞简易可行,培养的细胞活力好、表型可靠。     

大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养

目的 研究大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养.方法 用免疫组织化学技术研究大鼠表皮干细胞的分布;用DispaseⅡ、胰酶二步法消化新生大鼠皮肤,获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原筛选,体外培养大鼠表皮干细胞,进行免疫组化鉴定,荧光标记流式细胞仪分析.结果 在表皮基底层、毛囊外根鞘区α 6-integrin、K15等表皮干细胞标记物染色阳性,而分化指标CD71染色阴性;CD34在表皮基底层阴性表达,而在毛囊隆突区阳性表达;体外分离的基底层表皮干细胞生长良好,具有较高的克隆形成率;干细胞标记物α 6-integrin、 K15呈阳性表达,流式细胞仪检测α 6-integrin达到84%,说明较为成功地体外分离培养出大鼠表皮基底层干细胞.结论 在表皮基底层、毛囊外根鞘区存在表皮干细胞.     

大鼠表皮干细胞的定位、分离和体外培养

目的：定位大鼠的表皮干细胞，探讨表皮干细胞分离和体外培养的方法。方法：用免疫组化法定位表皮干细胞。用胶原酶冷、温消化和胰蛋白酶联合消化新生鼠皮肤，获得单细胞悬液。选取在鼠尾胶原上快速贴壁的细胞为目的细胞，未快速贴壁的细胞为对照组，二者在相同条件下培养，适时传代，测定细胞克隆形成率．免疫学方法鉴定表皮干细胞。结果：毛囊隆突区细胞胞浆表达角蛋白15（K15）随年龄的增长，K15阳性细胞出现在毛母质细胞区和表皮基底层。体外培养的细胞能形成大克隆，克隆形成率为14．06％，传至第4代，细胞形态无明显改变，细胞浆内表达K15。结论：表皮干细胞位于毛囊隆突区，此研究所用的方法可以分离、纯化和培养表皮干细胞。     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞(ES细胞)源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤,探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮,植入小鼠全层皮肤缺损创面,以生物膜为载体,把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上,术后1～8周连续取材,HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周,创面完全长合,较厚新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层,新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15、CK19阳性,真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性,4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性,新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤,在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构,但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

免疫荧光双标法在小鼠表皮干细胞分子标记筛选中的应用

目的用标记滞留细胞(LRCs)及免疫荧光双标记法进行小鼠表皮干细胞可靠分子标记的筛选。方法选择出生5 d的昆明小乳鼠进行腹腔注射5-溴,2-脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU),隔日注射,连续7 d。于注射后第90天进行取材,在冰冻切片上分别进行BrdU与整合素β1、P63和CD34的双重免疫荧光标记,观察这些标记物与BrdU的符合度。结果 90 d后小鼠皮肤上皮细胞中仍有少数阳性细胞,主要存在于毛囊的隆突部位,另有少数阳性细胞散落在基底层。免疫荧光双标的结果示,Brdu与整合素β1双标阳性的细胞占所有整合素β1阳性细胞的81%,占所有Brdu阳性细胞的94%;Brdu与P63双标阳性的细胞占所有P63阳性细胞的65%,占所有Brdu阳性细胞的86%;Brdu与CD34双标阳性的细胞占所有CD34阳性细胞的30%,占所有Brdu阳性细胞的62%。结论整合素β1与BrdU的符合率最高,P63其次。β1和P63是这些分子标记物中筛选干细胞最好的指标。     

毛囊干细胞定位和体外向表皮分化

目的研究毛囊干细胞在毛发不同生长周期中定位和体外向表皮分化能力。方法采用免疫荧光染色检测皮肤组织中K19表达;分离毛囊干细胞并体外培养,以成纤维细胞为底物,采用气-液界面立体培养,形态学观察毛囊干细胞体外向表皮分化能力。结果K19阳性细胞主要定位于毛囊外根鞘。生长期毛发中,K19阳性细胞主要位于毛囊外根鞘膨突处和下部毛球部;退行期和静止期毛发中K19阳性细胞则沿毛囊外根鞘处连续分布,并在新的生长周期开始再次分开为两处。体外采用真皮类似物立体培养外根鞘细胞,获得具有多层表皮结构的皮肤类似物。结论毛囊干细胞主要定位于毛囊外根鞘,并随毛囊周期性生长有所迁移,体外具有形成表皮结构的能力。     

毛囊干细胞的体外研究

毛囊是皮肤的重要附属器官,其生长具有周期性.这与其中存在的毛囊干细胞的功能密不可分.毛囊干细胞具有强大的增殖潜能及多向分化能力,可以分化成毛囊及表皮的多种细胞.它不仅对维持毛发的周期性生长有重要作用,同时也是表皮及皮肤附属器官再生的重要细胞来源.目前对成人毛囊干细胞的定位还没有明确的结论,多数的在体研究认为它可能存在于毛囊膨出部(立毛肌插入点附近)和外根鞘的最外层,其特点是体积小,分化程度低,具有慢周期性,特异性表达β1整合素和角蛋白19型(Keratin 19,K19).