SDF-1/HGF融合蛋白介导的大鼠间充质干细胞对造血干细胞增殖和趋化作用的影响

目的：研究基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）/肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）融合蛋白介导的骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stroma cell,BMSCs）对造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）增殖和趋化能力的影响,以期望通过联合移植的方式重建肝组织。方法：培养鉴定3~4周龄SD大鼠BMSCs及大鼠HSCs。荧光显微镜下观测重组腺病毒pAD-SDF-1-（GlySer）3-HGF-IRES-GFP感染BMSCs 1、3、7、14 d后的感染效率,同时ELISA检测SDF-1和HGF的表达。制备BMSCs细胞滋养层,HSCs种植于有滋养层的 24 孔板中,分为3组：HSCs加培养基组（A1组）;HSCs加BMSCs组（B1组）;HSCs加SDF/HGF融合蛋白介导的BMSCs组（C1组）,检测共培养1、3、7、14 d后HSCs的增殖倍数。利用transwell培养体系,按实验要求分为3组：HSCs加细胞培养液组（A2组）;HSCs加BMSCs组（ B2组）; HSCs加SDF/HGF融合蛋白介导的BMSCs（C2组）,测定HSCs的迁移指数。结果：重组腺病毒pAD-SDF-1-（GlySer）3-HGF-IRES-GFP感染BMSCs 1、3、7、14 d的感染效率分别为（25.28±3.72）%、（82.22±3.58）%、（64.85±4.48）%、（28.35±2.73）%,感染后第3天的感染效率最高（与第1、7、14天相比较,F=718.05,P＝0.000;F=66.80,P＝0.000;F=642.78,P＝0.000）。重组腺病毒pAD-SDF-1-（GlySer）3-HGF-IRES-GFP感染BMSCs 1、3、7、14 d后,SDF-1的表达分别为：（1.02±0.15） μg/ml,（4.51±0.52） μg/ml,（2.18±0.19） μg/ml,（1.22±0.21） μg/ml;HGF的表达分别为：（1.38±0.32） ug/ml,（5.01±0.43） μg/ml,（3.10±0.26） μg/ml,（1.63±0.27） μg/ml。感染后第3天SDF-1与第1、7、14天比较和HGF与第1、7、14天比较的表达明显增高（P均＝0.000）。BMSCs和HSCs共培养第3、7、14天,B1组、C1组中HSCs的扩增倍数明显高于A1组（P均＝0.000）。同时C1组中HSCs的扩增倍数明显高于B1组（P均＝0.000）。transwell显示B2、C2组的迁移指数明显高于A2组,同时C2组的迁移指数明显高于B2组。结论：SDF-1/HGF融合蛋白介导的BMSCs 可能在促进HSCs的增殖及趋化方面起到重要作用。     

姜黄素影响N2a/APP695swe细胞中ABCA1表达的机制研究

目的：研究姜黄素（Curcumin）对N2a/APP695swe细胞钙调神经磷酸酶（Calcineurin,CaN）活性和三磷酸腺苷结合转运子A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）表达的影响;探讨Curcumin影响N2a/APP695swe细胞中ABCA1表达的可能机制。方法：MTT法分别检测1、5、10、20、40 μmol/L Curcumin或0.1、0.5、1、2、4 μmol/L CaN活性抑制剂环孢素A（Cyclospo－rinA,CsA）对N2a/APP695swe细胞存活率的影响;依据MTT筛选结果,分为正常对照组、模型组、Curcumin组：5 μmol/L Cur－cumin处理24 h的N2a/APP695swe细胞、CsA组：0.5 μmol/L CsA处理48 h的N2a/APP695swe细胞。酶底物显色法检测CaN活性,real-time PCR、Western blot检测ABCA1表达水平的变化。结果：与未处理组比较,5 μmol/L Curcumin组细胞存活率[（110.495±4.005）%]最高（P=0.023）;0.1、0.5、1、2、4 μmol/L CsA组细胞存活率依次为（105.532±4.292）%、（115.211±4.826）%、（76.317±4.475）%、（69.177±5.267）%、（54.687±3.912）%,与未处理组比较,0.5、1、2、4 μmol/L CsA组差异均有统计学意义（P值依次为0.001、0.000、0.000、0.000）;酶底物显色法显示与正常对照组[（18.519±1.664） nmol/mg]比较,模型组CaN活性[（24.488±3.041） nmol/mg]增加（P=0.007）,Curcumin组[（16.717±2.055） nmol/mg]、CsA组[（4.928±1.232）nmol/mg] CaN活性明显受到抑制（P值依次为0.002、0.000）;real-time PCR和Western blot显示Curcumin组ABCA1表达量（real-time PCR：1.988±0.355;West－ern blot：0.294±0.015）高于模型组（real-time PCR：1.000±0.000;Western blot：0.175±0.008）,差异有统计学意义（real-time PCR：P=0.009;Western blot：P=0.000）;与模型组比较,CsA组（real-time PCR：4.000±0.464;Western blot：0.470±0.016）的ABCA1表达水平增加（real-time PCR：P=0.000;Western blot：P=0.000）。结论：Curcumin能上调N2a/APP695swe细胞中ABCA1的表达,其机理可能与抑制CaN活性有关。     

Wnt/β-catenin/TCF-4信号通路调节livin表达在肾癌细胞增殖凋亡中的研究

目的：研究人肾癌细胞系786-0中Wnt/β-catenin/TCF-4通路与livin的关系,探索Wnt/β-catenin/TCF-4通路在肾癌细胞中的凋亡调节机制。方法：不同浓度吲哚美辛处理肾癌786-0细胞,CCK-8法检测各组细胞活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡改变;荧光定量PCR检测β-catenin、TCF-4、caspase-3及livin转录水平变化;Western blot检测β-catenin、caspase-3及livin蛋白表达水平变化。结果：随吲哚美辛浓度增加,细胞活力降低,呈剂量-效应关系（P=0.000）。流式结果显示伴随吲哚美辛浓度升高,细胞凋亡逐渐增加,25 μmol/L组、50 μmol/L组和100 μmol/L组凋亡率分别为（32.07±1.01）%、（40.03±1.95）%和（72.33±0.02）%,与对照组比较差异存在统计学意义（P=0.000,P=0.002,P=0.000）。Real-time PCR结果显示,β-catenin、TCF-4和livin相对表达水平均呈下降趋势（P=0.002,P=0.000,P=0.000）,而caspase-3相对表达呈明显上升趋势（P=0.001）。Western blot分析显示在25 μmol/L组、50 μmol/L组和100 μmol/L组中β-catenin相对表达量分别为0.568±0.020（P=0.001）、0.396±0.030（P=0.000）、0.142±0.038（P=0.000）;livin相对表达量分别为0.139±0.016（P=0.005）、0.050±0.006（P=0.000）、0.011±0.001（P=0.000）;而caspase-3相对表达量分别为0.278±0.035（P=0.046）、0.396±0.071（P=0.000）、0.518±0.015（P=0.000）。结论：吲哚美辛介导的肾癌细胞中β-catenin/TCF-4降解可能导致livin的转录抑制和caspase-3表达水平的上调,进而诱导肾癌细胞凋亡。     

柚皮素抑制DN系膜细胞炎症因子表达的分子机制研究

目的：研究柚皮素（naringenin,NAR）对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）小鼠病情影响和肾小球系膜细胞炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）表达的作用。方法：将10只雄性db/db DN小鼠随机分成柚皮素组和DN组,每组各5只;5只雄性db/m正常对照小鼠为正常组进行实验。其中柚皮素组小鼠给予50 mg/（kg×d）柚皮素连续灌胃2周处理,DN组小鼠给予等量生理盐水连续灌胃2周处理,正常组小鼠给予正常饮食。检测体质量、血糖、尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion,UAE）等一般指标;HE染色和电镜检测小鼠肾脏组织肾小球形态学改变。将小鼠肾小球系膜细胞给予不同葡萄糖浓度（5 mmol/L和25 mmol/L）的DMEM培养基培养。其中5 mmol/L葡萄糖浓度培养的细胞为正常组,25 mmol/L葡萄糖浓度培养的细胞为高糖组,25 mmol/L葡萄糖浓度培养基中加入柚皮素400 μmol/L培养的细胞为柚皮素组。ELISA法检测炎症因子TNF-α和IL-6表达;Western blot检测细胞质和细胞核的NF-κB p65蛋白表达情况。结果：DN小鼠给予柚皮素后,UAE[（51.48±8.54） μg/24 h]较DN组[（99.3±5.15） μg/24 h]降低（F=254.302,P=0.000）;肾小球面积[（2 098±571.84） μm2]较DN组[（4 240±536.66） μm2]减少（F=24.468,P=0.000）;电镜下系膜增生抑制。同时,给予柚皮素的肾小球系膜细胞炎症因子TNF-α和IL-6表达水平（1.99±0.29,1.76±0.15）较高糖组（2.82±0.14,2.53±0.32）下降（F=111.303,P=0.000;F=65.127,P=0.000）;细胞核NF-κB p65（0.29±0.01）较高糖组（0.81±0.02）降低（F=1579.764,P=0.000）。结论：柚皮素可缓解DN小鼠尿白蛋白和减少系膜增生,其机制可能是在系膜细胞中通过抑制NF-κB介导的炎症因子表达。     

半边旗二萜类化合物5F对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及Fas蛋白表达的影响

目的　观察中药半边旗二萜类化合物 5F对瘢痕疙瘩成纤维细胞 (keloidfibrolast,KFB)凋亡及对Fas蛋白表达的影响。方法　体外培养KFB ,①收集以浓度为 32 μg/ml的 5F作用 12、2 4、36、4 8h后的细胞 ;②收集分别用浓度为 8、32、6 4、 12 8μg/ml 5F作用 4 8h后的细胞 ,应用流式细胞仪 (FCM )检测成纤维细胞的凋亡率及Fas蛋白的表达。结果　① 5F作用 12～ 4 8h成纤维细胞出现明显的凋亡 (P <0 0 1) ,对照组成纤维细胞未见明显凋亡 ;②随着药物浓度的增大Fas蛋白表达也增高 (P <0 0 1)。结论　 5F可以诱导KFB细胞凋亡 ,促进Fas蛋白的表达。     

TCDD宫内暴露致雄性子代大鼠生殖毒性研究

目的：探讨2-3-7-8四氯二苯并二噁英（2-3-7-8 Tetrachlorodibenzo-p-Dioxin,TCDD）宫内暴露对雄性子代生殖毒性的影响及机制。方法：成功交配后,将母鼠随机分组。高剂量组（0.5 μg/kg）、低剂量组（0.1 μg/kg）和溶剂对照组,每组各6只,TCDD组及对照组于孕8~14 d（gestation day 8-14,GD8-14）采用灌胃方式分别给予TCDD及玉米油处理。孕鼠自然分娩,测量雄性仔鼠肛门至生殖器的距离（anal to genital distance,AGD）;计算睾丸的脏器系数;利用精子质量分析仪对仔鼠精子的质量及数量进行分析测定;酶联免疫吸附法对雄性子代血清睾酮（testosterone,T）水平进行测定;测定凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Caspase-3的表达水平。结果：0.1 μg/kg组、0.5 μg/kg组仔鼠与对照组仔鼠相比,AGD[（1.49±0.04） cm、（1.32±0.01） cm和（1.21±0.02） cm]有所缩短（P=0.000）,精子数目[（72.33±4.46）×106个/mL、（63.67±3.44）×106个/mL、（45.33±5.47）×106个/mL]与精子活率[（78.53±1.26）%、（64.40±3.14）%、（53.87±3.65）%]明显降低,精子畸形率[（2.17±0.75）%、（4.83±0.75）%、（8.00±1.10）%]升高（P=0.000）,血清中T水平[（2.68±0.06） ng/mL、（2.38±0.08） ng/mL和（2.10±0.09） ng/mL]明显下降（P=0.000）,差异均有统计学意义,0.5 μg/kg TCDD组雄性仔鼠的睾丸质量（P=0.001）和睾丸脏器系数（P=0.004）降低的差异有统计学意义;睾丸组织细胞Bax蛋白相对表达量（0.836±0.004、1.185±0.004、1.414±0.001）随染毒剂量的递增而上升（P=0.000）,Bcl-2（1.368±0.053、1.108±0.040、0.751±0.022）则相反（P=0.001）,同时,0.5 μg/kg TCDD染毒组Pro-Caspase-3蛋白表达明显降低,但Cleaved-Caspase-3蛋白表达明显增加（P=0.000）。结论：宫内暴露TCDD可使雄性仔鼠出现雌性化特征,影响雄性仔鼠生育能力,对雄性子代具有生殖毒性,其机制可能与仔鼠睾丸组织细胞增殖-凋亡失衡和细胞凋亡的线粒体通路被激活有关。     

顺铂通过ROS促进乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的：探索顺铂（cisplatin）促进乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的分子机制。方法：采用不同浓度的顺铂处理稳定表达HBV的HepAD38细胞,台盼蓝染色检测细胞活力,筛选出顺铂最适浓度,分别采用Real-time PCR和Southern blot检测HBV DNA水平,Western blot检测HBsAg和HBcAg蛋白表达。在顺铂诱导组加或者不加氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）,采用CellROX Orange Reagent染料在激光共聚焦显微镜下检测细胞内ROS水平,并且检测HBV DNA 水平、HBsAg及HBcAg的蛋白水平。结果：台盼蓝染色筛选出顺铂的最适浓度为6 μmol/L。Real-time PCR实验结果显示,PBS组,0.5、2.0、6.0 μmol/L顺铂处理后HBV DNA 拷贝数/细胞分别为515.152±18.924、1 215.758±49.001（P=0.000）、1 678.182±117.223（P=0.000）、2 110.606±143.640（P=0.000）;Southern blot结果与Real-time PCR结果一致,顺铂以剂量依赖方式增加HBV DNA水平。Western blot结果表明,与PBS组相比,6.0 μmol/L顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.102±0.099（P=0.000）、4.001±0.200（P=0.000）;顺铂可以促进HBV复制和病毒蛋白的表达。进一步采用NAC与顺铂联合处理HepAD38细胞,Real-time PCR实验结果表明,顺铂组、顺铂+NAC组HBV DNA 拷贝数/细胞分别为2 180.444±82.573（P=0.000）、1 041.778±50.918（P=0.000）,2组差异具有统计学意义。Western blot实验结果表明,顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.139±0.061（P=0.000）、3.812±0.109（P=0.000）,顺铂+NAC组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为2.101±0.088（P=0.000）、1.613±0.073（P=0.000）,2组之间HBsAg、HBcAg蛋白差异均具有统计学意义。结论：顺铂通过增强细胞内ROS水平,促进HBV复制,而NAC可以部分抑制顺铂刺激的HBV复制作用。     

干扰素α-2a与α-2b的免疫原性研究

目的：观察干扰素α-2a（interferon α-2a,IFNα-2a）与干扰素α-2b（interferon α-2b,IFNα-2b）对昆明小鼠的免疫原性与免疫毒性。方法：实验设阳性对照P组（环磷酰胺,cytoxan,CTX,200 mg/kg）、IFNα-2b高剂量组（A组,2 μg/mL）、IFNα-2b低剂量组（B组,0.5 μg/mL）、IFNα-2a高剂量组（C组,2 μg/mL）、IFNα-2a低剂量组（D组,0.5 μg/mL）以及阴性对照组（溶剂对照组,N组,0.1%牛血清蛋白Bovine serum albumin 0.1%BSA）,每组8只腹腔注射给药5周。通过血清干扰素（interferon,IFN）浓度、干扰素抗体（antibodies of interferon,Anti-IFN）浓度及肾脏C3补体免疫组化进行免疫原性对比;通过小鼠体质量增量、脏器系数、血液学指标、免疫球蛋白以及脾脏组织病理学切片进行免疫毒性对比。结果：血清IFN浓度A组（9.27±0.79）高于C组（7.80±1.26）（P=0.000）;B组（7.91±1.09）高于D组（5.97±0.98）（P=0.013）。血清Anti-IFN浓度A组（7.49±1.30）低于C组（10.31±0.69）（P=0.000）;B组（6.18±1.02）低于D组（8.24±0.74）（P=0.013）。肾脏C3免疫组化A组（0.51±0.00）低于C组（0.54±0.00）（P=0.000）;B组（0.42±0.00）低于D组（0.47±0.00）（P=0.013）。体质量增长量A组低于C组（P=0.015）;B组低于C组（P=0.003）。脏器系数实验组与阴性对照组N组无差异。A、B、C、D组在白细胞计数（white blood cell count,WBC）、血小板计数（platelet count,PLT）、平均血红蛋白量（mean corpuscular hemoglobin,MCH）、淋巴细胞计数（lymphocyte count,LY）、淋巴细胞百分比（lymphocytes percentage,LY%）指标上高于N组但低于P组（P<0.05）。IgA、IgM、IgG浓度检测无统计学差异。干扰素实验组脾脏切片未发现病理结构改变。结论：IFNα-2a与IFNα-2b的免疫原性有差异;免疫毒性无明显差异。     

5-氮杂-2-脱氧胞苷对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响

目的：探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的抑制作用及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞相关因子的影响。方法：收集人瘢痕疙瘩以及周围正常皮肤标本原代培养成纤维细胞,分为瘢痕疙瘩成纤维细胞5-氮杂-2-脱氧胞苷药物干预组、瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组、正常皮肤成纤维细胞5-氮杂-2-脱氧胞苷药物干预组及正常皮肤成纤维细胞对照组4组,用RT-PCR检测各组转化生长因子－β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）mRNA、Smad7mRNA的表达,流式细胞术（flow cytometry,ＦＣＭ）检测各组细胞的周期及凋亡。结果：人瘢痕疙瘩成纤维细胞较正常皮肤成纤维细胞TGF-β1mRNA表达增高（P=0.001）,Smad7mRNA表达降低（P=0.001）,细胞周期停滞于G0/G1期（P=0.035）及细胞凋亡（P=0.006）比例降低;5-氮杂-2-脱氧胞苷干预人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,TGF-β1mRNA表达降低（P=0.003）,Smad7mRNA回升（P=0.000）,ＦＣＭ显示瘢痕疙瘩成纤维细胞停滞于G0/G1期比例增加（P=0.000）并且细胞凋亡率增加（P=0.047）,而正常皮肤成纤维细胞组无明显变化（P均>0.05）。结论：甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可影响瘢痕疙瘩形成相关因子的表达并且可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及促进其凋亡,而对正常皮肤的成纤维细胞无明显影响。瘢痕疙瘩的发病可能与相关基因甲基化有关,5-氮杂-2-脱氧胞苷可能成为瘢痕疙瘩治疗的新选择。     

姜黄素调控脂多糖诱导成骨细胞线粒体功能改变及凋亡研究

目的：研究脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和姜黄素（curcumin,Cur）对成骨细胞线粒体功能活性改变及凋亡的影响。方法：体外培养小鼠原代成骨细胞,并将细胞分为4组：无任何处理的对照组（N组）;10 μmol/L姜黄素预处理2 h,使用正常培养基培养24 h组（Cur组）;用1 mg/L LPS处理24 h组（LPS组）;用10 μmol/L姜黄素预处理2 h,然后再用1 mg/L LPS处理成骨细胞24 h组（Cur +LPS组）。利用线粒体荧光探针测量线粒体活性氧的产生,检测线粒体氧化呼吸链酶活性、线粒体膜电位、细胞内ATP的合成及细胞凋亡情况。结果：在经过1 mg/L LPS刺激后,小鼠成骨细胞线粒体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成为对照组的2.59倍;与对照组相比,LPS组氧化呼吸链酶Ⅰ活性降低21%,氧化呼吸链酶Ⅲ活性降低26%,氧化呼吸链酶Ⅳ活性降低28%;线粒体细胞膜电位降低32%,ATP合成量为（0.79±0.06） μmol/mg蛋白,细胞凋亡数目增加3.2倍;而Cur+LPS组较LPS组相比,小鼠成骨细胞内ROS水平降低（1.48±0.21 vs. 2.59±0.32,P=0.003）,氧化呼吸链酶Ⅰ活性升高（0.98±0.02 vs. 0.79±0.03,P=0.000）,氧化呼吸链酶Ⅲ活性升高（0.93±0.03 vs. 0.74±0.03,P=0.004）,氧化呼吸链酶Ⅳ活性升高（0.92±0.05 vs. 0.72±0.02,P=0.009）,线粒体膜电位增加（0.91±0.04 vs. 0.68±0.04,P=0.002）,ATP合成量增加（1.53±0.05 vs. 0.79±0.06,P=0.000）,细胞凋亡数目减少（1.67±0.42 vs. 5.33±0.80,P=0.002）。结论：姜黄素预处理组的成骨细胞线粒体功能得以明显改善,并且细胞凋亡数目明显减少,为姜黄素可能被进一步应用于临床治疗慢性牙周炎提供一定的实验依据。