靶向重组腺病毒载体逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性.结果 EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine 123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长.     

靶向MDR1基因siRNA逆转HepG2/ADM细胞耐药性的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人类肝癌细胞系/阿霉素(human hepatocellular liver carcinoma cell line/adriamycin,HepG2/ADM)细胞中多耐药基因,探讨该基因能否有效地抑制多耐药基因(multidrug resistance gene,MDR1)及其编码的糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,并检测对HepG2/ADM耐药表型的逆转效果.方法 采用药物大剂量冲击法建立HepG2/ADM耐药模型,构建靶向MDR1的小干扰RNA表达载体,并转染到HepG2/ADM细胞中,应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测基因转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,Western-blot检测各组细胞P-gp蛋白表达的变化,用噻唑蓝法检测各组细胞对阿霉素、顺铂、长春新碱和氟尿嘧啶等药物的敏感性.结果 HepG2/ADM细胞系不仅对阿霉素耐药,而且对其他化疗药也有抗性,呈现多药耐药特性;重组质粒鉴定结果表明针对MDR1的小干扰RNA表达载体成功构建;与对照组比较,转入细胞后MDR1 mRNA水平明显下降,P-gp蛋白表达明显降低;转入细胞后HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性明显提高,部分逆转其耐药性.结论 靶向MDR1的小干扰RNA可显著抑制HepG2/ADM细胞中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,逆转P-gp介导的HepG2/ADM细胞的耐药性.     

RNA干扰逆转白血病细胞耐药性的研究

目的 用RNA干扰技术下调白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药基因mdr1的表达以逆转白血病对化学药物的耐药性.方法 针对mdr1基因已知mRNA序列不同位点,选择两条靶序列,构建靶向mdr1 shRNA真核表达载体,脂质体介导转染白血病耐药细胞株K562/A02.实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达,Western blot检测细胞膜P-gp表达,柔红霉素泵出试验检测P-gp外排泵功能,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性.结果 构建了二条针对mdr1基因的shRNA真核表达载体,分别下调mdr1 mRNA的表达89.74%和87.18%,降低细胞膜P-gp表达,使膜外泵功能明显下降,柔红霉素在细胞内贮留明显增多,60min 时柔红泵出率为13.16%、22.02%,对照组为40.44%、45.31%,对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为84.36%和76.69%.结论 RNA干扰技术可有效逆转mdr1所致耐药.     

小干扰RNA诱导人卵巢癌细胞MDR1基因沉默的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人卵巢癌OVCAR8/TR细胞中多药耐药基因,探讨该技术能否有效地抑制多药耐药基因MDR1的表达,降低该基因编码的糖蛋白P-gp的水平.方法 设计合成针对MDR1的小片段RNA(siRNA),将合成的siRNA用脂质体转染具有多药耐药基因MDR1高表达的人卵巢癌泰素耐药细胞株OVCAR8/TR,用荧光定量RT-PCR检测转染后不同时间点MDR1的mRNA的变化,流式细胞仪定量测定转染后不同时间点P-gp表达的情况.结果 MDR1的siRNA转染细胞48 h基因的抑制达最高,转染的第5 d回到正常水平.阴性对照组mRNA的量与未转染组的mRNA的量差异无统计学意义.P-gp在转染后的72 h其抑制最强,至第5 d时恢复接近正常水平,阴性对照组蛋白表达与未转染组的蛋白表达差异无统计学意义.结论 siRNA能够有效地抑制多药耐药基因MDR1的mRNA和P-gp的表达,为逆转卵巢癌的多药耐药带来了新的希望.     

靶向mdr1b/mdr1a基因siRNA逆转T24/ADM多药耐药性研究

目的:研究mdr1b/a基因siRNA(small interfering RNA)逆转膀胱癌的多药耐药性。方法:设计mdr1b/a基因的siRNA,转染膀胱癌T24/ADM细胞,用RT-PCR分析mRNA的表达,Rh123分析P-gp活性,流式细胞仪检测细胞内阿霉素积累量。结果:siRNA能明显地逆转T24/ADM细胞的多药耐药,使mdr1b/a基因的mRNA表达水平下调,细胞内阿霉素积累量显著增加(P<0.05)。结论:mdr1b/a基因siRNA能够逆转膀胱癌的多药耐药性。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

真核表达质粒pcDNA3．1／EGR-1的构建和体外效应研究

目的 构建早期生长反应基因(early growth response gene-1,EGR-1)真核表达载体,体外观察其对卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol的影响.方法 将EGR-1基因重组于pcDNA 3.1质粒中,稳定转染A2780/Taxol细胞,流式细胞仪检测转染对A2780/Taxol细胞凋亡的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察A2780/Taxol细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR检测转染前后EGR-1及MDR1 mRNA的表达水平.结果 经酶切和测序鉴定,成功构建质粒peDNA 3.1/EGR-1;RT-PCR显示,外源性EGR-1基因已整合于A2780/Taxol细胞并获稳定表达;转染使细胞凋亡明显增加(P<0.01);恢复A2780/Taxol细胞对紫杉醇药物敏感性;MDR1 mRNA表达显著下调.结论 转染EGR-1可降低A2780/Taxol凋亡的阈值和下调MDRl的表达,从而减少A2780/Taxol细胞对紫杉醇的耐受性.     

腺病毒介导的靶向自杀基因对卵巢癌耐药细胞株的杀伤作用

目的研究多药耐药基因1（mdr1）调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因（CD∷UPP）联合5-氟胞嘧啶（5-FC）后对卵巢癌紫杉醇耐药细胞株生长的影响。方法以复制缺陷型重组腺病毒为载体，将mdr1-CD∷UPP基因分别转染2对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol、SKOV3/Taxol及非耐药细胞株A2780和SKOV3，加入含5-FC的培养液培养，5 d后噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，观察旁观者效应。结果5-FC对转基因耐药细胞的生长抑制作用明显高于转基因的非耐药细胞，随着5-FC浓度增加，抑制作用增强；通过旁观者效应5-FC可杀伤周围未转基因的耐药细胞。结论mdr1-CD∷UPP靶向自杀基因联合5-FC后对紫杉醇耐药细胞具有显著的特异性杀伤作用。     

miR-130a对卵巢癌A2780细胞顺铂耐药性的影响及其机制的研究

目的 探讨miR-130a表达的改变对卵巢癌A2780细胞（包括顺铂敏感细胞株A2780s和耐药株A2780/DDP）顺铂耐药性的影响及其机制。方法 将A2780s、A2780/DDP细胞各分为4组,分别予以单纯脂质体处理、转染阴性对照小RNA、miR-130a模拟物(可使miR-130a表达增加)、miR-130a抑制物(降低miR-130a表达)处理,MTS法检测各组细胞增殖情况和对顺铂的耐药性,RT-PCR、Western blot 法检测未处理和处理后细胞多耐药基因1（MDR1）、抑癌基因（PTEN） mRNA和蛋白的表达。结果 A2780/DDP细胞MDR1 mRNA和MDR1的表达产物P-糖蛋白(P-gp）的表达高于A2780s细胞（PMDR1 mRNA和P-gp表达水平;下调miR-130a的表达,同样不影响细胞的增殖, 但增强其对顺铂的敏感性, 并可降低MDR1 mRNA和P-gp的表达,提高PTEN蛋白的表达。结论 miR-130a抑制物通过上调PTEN蛋白和下调P-gp的表达来逆转卵巢癌A2780细胞系对顺铂的耐药性。miR-130a有望成为耐药性卵巢癌基因治疗的新靶点。     

靶向抑制肝癌耐药细胞多药耐药基因表达的实验研究

目的：构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状RNA（shorthairp in RNA,shRNA）表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mRNA的抑制作用。方法：利用分子克隆技术,将含MDR1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,RT-PCR分析MDR1mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞P-gp的表达。结果：PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制MDR1mRNA的表达;P-gp的表达阳性率降低了57.3%,P〈0.05。结论：构建的pshRNA-MDR1表达质粒能靶向抵制肝癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点，诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据，做出准确诊断，给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂，腹腔内疾病占64．63％，共17种病因；腹腔外疾病占35．37％，共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查，在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。