金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。     

巴斯德杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立巴斯德杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为实验动物的呼吸道细菌的控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对Genbank中13株巴斯德杆菌的RNA聚合酶β亚基(rpo B)氨基酸序列设计简并引物。对建立CODEHOP PCR方法用21株参考菌株进行特异性和敏感性评价,并应用于实验动物中的巴斯德杆菌检测。结果简并引物Past F6/PastR5扩增标准菌株的目的片段为200 bp左右。能够区分受试的巴斯德杆菌和主要的实验动物呼吸道病原菌。敏感性为0.2 pg/μL~2 pg/μL。在受试的609只实验动物中呼吸道样品中检测出巴斯德杆菌阳性率为19.1%。样品阳性片段经测序验证,准确率为100%。结论所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于动物样品中巴斯德杆菌的检测。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种简便、快速、敏感、特异的适用于支气管败血波氏杆菌的PCR检测方法。方法根据兔支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）的fim2基因序列设计了一对特异性引物，进行PCR扩增、特异性和敏感性试验，并将其应用于临床样品的检测。结果利用该PCR方法扩增出425bp的目的基因片段，该产物序列与GeneBank上公布的基因序列同源性为100％。特异性试验表明，该方法对大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌均无交叉性反应；并且最小可检出菌液浓度为3．6CPU。用该PCR方法检测了从江苏、山东等地采集的146份兔鼻拭子，结果检出支气管败血波氏杆菌阳性92例，阳性率为63．01％。结论建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

多重PCR结合毛细管电泳检测儿童呼吸道病原体方法的建立及应用

目的：建立肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.au）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.Ae）、阴沟杆菌（Enterobacter cloacae，Ecl）、白色假丝酵母菌（Candida albicans，Cal）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Aba）7种儿童呼吸道病原体多重PCR结合毛细管电泳法检测体系。方法：随机收集南京市儿童医院2020年11—12月266例儿童呼吸道病原体样本，针对MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、Cal、Aba保守序列设计特异性引物，设计并优化多重PCR结合毛细管电泳检测体系；将该检测结果与细菌培养以及荧光定量PCR比对，评估该方法的检测性能（灵敏度、特异度）。结果：所设计引物可以特异性扩增出呼吸道病原体；多重PCR结合毛细管电泳检测体系检出敏感性高；与其他呼吸道感染病原体未出现交叉反应，无明显的非特异峰，特异性较好。结论：成功建立一种能够快速筛查7种常见儿童呼吸道病原体的多重PCR结合毛细管电泳的检测方法。     

血红素加氧酶-1显性负性突变体转基因小鼠模型的建立与鉴定

目的对泰泽病原体nested—PCR检测方法进行优化和应用研究。方法以感染泰泽病原体RJ株的大鼠肝组织作为阳性对照,按国标GB/T 14926．10—2008《实验动物泰泽病原体检测方法》间接免疫荧光检测fIFA）呈阳性的上海地区大鼠肝组织为材料,对本室已建立的泰泽病原体nested—PCR检测方法中的DNA抽提方法和PCR过程进行优化,并应用于22只免疫抑制实验动物的泰泽病原体检测。结果肝脏组织DNA以酚／氯仿抽提法为好;nested—PCR出现196bp的特异性条带,此方法的敏感性达1pg;产物纯化后进行测序比对分析显示,上海地区实验大鼠感染样品以及RJ株感染样品的序列均与Genbank中泰泽病原体16S rRNA（Genbank D14638．1）的同源性为100％。应用研究表明,22个样品中IFA检测阳性样品8个,阳性率为36．4％;Nested-PCR检测阳性样品13个,包含所有的IFA阳性样品,阳性率为59．1％。结论本方法灵敏度高,特异性强,经进一步应用改进后,可用于泰泽病原体的检测。     

实验犬布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定

目的建立实验犬及相关生物制品布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定方法。方法选择布氏杆菌Omp2基因同源性较高的区域设计引物对布氏杆菌进行多重PCR扩增,扩增结果一致的样本进行酶切以区分不同型,同时进行序列测定,以确定该方法的准确性;然后验证该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增得到目的条带,并通过酶切区分五种布氏杆菌;PCR产物与布氏杆菌DNA序列同源性达到99%,并验证了该方法的检测结果。实验结果证明该方法特异性较好,灵敏性为1.8×10-7μg/mL。结论成功建立布氏杆菌多重PCR检测与分型鉴定方法,所建立的方法特异性好,灵敏度高。本研究对保证实验犬群的质量,保护饲养人员、实验人员的身体健康具有重要意义。     

实验动物CAR杆菌16SrRNA基因PCR监测方法的建立

目的 建立CAR杆菌的PCR监测方法,筛查国内部分实验动物样本中CAR杆菌携带状况.方法 利用CAR杆菌的特有16SrRNA基因序列片段267bp设计引物,通过从日本实验动物中央研究所获取的CAR标准株DNA,建立实验动物CAR杆菌16SrRNA基因PCR监测方法.结果 利用建立的CAR杆菌16SrRNA基因PCR监测方法对国内455份实验动物样本进行筛查,未检出CAR杆菌感染.结论 建立了敏感性好,特异性高的实验动物CAR杆菌PCR监测方法,未见动物携带CAR杆菌.     

鼠棒状杆菌PCR检测方法的建立及其应用

目的建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并应用于临床样本检测。方法用脑心浸出液培养基复苏、培养鼠棒状杆菌(corynebacterium kutscheri,C.kutscheri)并提取基因组DNA作模板;根据GenBank中C.kutscheri的16S基因序列设计合成引物,建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并进行敏感性和特异性的评价;人工感染昆明鼠,建立小鼠棒状杆菌感染模型,采集肝脏和肾脏,提取DNA进行检测。结果成功建立了鼠棒状杆菌PCR检测方法,该方法可检测到100个阳性质粒;对小鼠沙门氏菌、肺炎链球菌和巴氏杆菌无交叉反应;全部8个人工感染样本全部检测为阳性。结论建立的鼠棒状杆菌PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可作为鼠棒状杆菌感染的快速检测方法。     

培养法和PCR法用于实验大、小鼠细菌检测的比较分析

目的 比较培养法和PCR法对实验大、小鼠的细菌检测效果。方法 分别采用传统细菌分离培养结合生化鉴定方法和PCR方法, 对78只SPF级大鼠和422只SPF级小鼠进行检测, 对两种方法的检测结果进行比较分析。结果 78只SPF级大鼠均未检测出阳性。422只SPF级小鼠, 培养法检测阳性率7.11%(30/422), 其中金黄色葡萄球菌10只, 绿脓杆菌22只, 肺炎克雷伯杆菌2只。PCR法检测阳性率7.58%(32/422), 其中金黄色葡萄球菌10只, 绿脓杆菌25只, 肺炎克雷伯杆菌2只。结论 PCR法的敏感性高于培养法, 操作简便、快捷, 适用于实验动物细菌的快速诊断和大规模的质量筛查。     

胆汁螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立快速、敏感、特异的胆汁螺杆菌(Helicobacter bilis,H.bilis)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对胆汁螺杆菌进行定量检测。方法 PCR扩增H.bilis保守基因P17序列全长ORF435 bp,进行TA克隆,构建质粒标准品pMD-HBP17。通过对pMD-HBP17标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性及重复性;用所建立的qPCR方法检测77份临床样品,并与普通PCR的检测结果作比对。结果 所建立的qPCR检测方法,质粒DNA浓度在10⁸~10¹拷贝之间表现出较好的线性和相关性,所得标准曲线的斜率为-3.46,相关系数为0.999,检测灵敏度达到20个拷贝,对77份临床样品的检出率为14.3%,较普通PCR(7.8%)的检出率高。结论 建立的H.bilis qPCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可用于胆汁螺杆菌的定量及定性检测。     

2013年~2015年广东地区实验小鼠和大鼠微生物学及寄生虫学调查

目的 调查2013~2015年广东地区实验小鼠和大鼠的病原携带情况。方法 本文涉及的样品主要来源于监督检测的抽样样品和委托检测的送样样品,共收集到广东省12家监督单位和32家委托单位样品。按照国家标准要求的项目及标准外的螺杆菌和小鼠诺如病毒进行检测。结果 监督检测和委托检测结果存在较大差异。3年中监督检测的小鼠检出4种病原,包括绿脓杆菌（0.7%）、嗜肺巴斯德杆菌（0.3%）、肺炎克雷伯杆菌（0.7%）和鞭毛虫（1.7%）,未检出病毒;大鼠检出1种病原即嗜肺巴斯德杆菌（1.1%）,未检出病毒和寄生虫。委托检测的小鼠检出15种病原,包括绿脓杆菌（3.7%）、嗜肺巴斯德杆菌（5.2%）、支原体（1.9%）、金黄色葡萄球菌（0.7%）、肺炎克雷伯杆菌（0.8%）、螺杆菌（45.3%）,小鼠肝炎病毒（8.5%）、小鼠脑脊髓炎病毒（7.0%）、小鼠诺如病毒（16.2%）、鼠痘病毒（0.3%）、小鼠细小病毒（0.5%）、仙台病毒（0.1%）、鞭毛虫（11.7%）、蠕虫（1.0%）、体外寄生虫（0.1%）。大鼠检出8种病原,包括绿脓杆菌（3.4%）、嗜肺巴斯德杆菌（8.6%）、支原体（0.9%）、金黄色葡萄球菌（2.9%）、泰泽病原体（4.8%）、大肠杆菌（1.0%）、大鼠细小病毒H-1株（3.0%）、大鼠冠状病毒（1.0%）,未检出寄生虫。其中,实验小鼠7种病原,包括绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌、鞭毛虫、小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒和小鼠诺如病毒,大鼠2种病原,包括金黄色葡萄球菌和泰泽病原体,检出范围广、检出率较高,而且存在区域分布特点,即设施污染后能在多次送检的动物中检出这些病原。结论 本研究获得广东省实验大小鼠病原流行情况和分布,这些数据的统计为我国实验动物质量标准的制订提供基础数据,同时也为各动物实验设施的质量控制方案制订提供依据。     

Original Article Simultaneous Detection of 13 Key Bacterial Respiratory Pathogens by Combination of Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Objective Lower respiratory tract infections continue to pose a significant threat to human health. It is important to accurately and rapidly detect respiratory bacteria. To compensate for the limits of current respiratory bacteria detection methods, we developed a combination of multiplex polymerase chain reaction (PCR) and capillary electrophoresis (MPCE) assay to detect thirteen bacterial pathogens responsible for lower respiratory tract infections, including Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp., Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis complex, Corynebacterium diphtheriae, and Streptococcus pyogenes. Methods Three multiplex PCR reactions were built, and the products were analyzed by capillary electrophoresis using the high-throughput DNA analyzer. The specificity of the MPCE assay was examined and the detection limit was evaluated using DNA samples from each bacterial strain and the simulative samples of each strain. This assay was further evaluated using 152 clinical specimens and compared with real-time PCR reactions. For this assay, three nested-multiplex-PCRs were used to detect these clinical specimens. Results The detection limits of the MPCE assay for the 13 pathogens were very low and ranged from 10-7 to 10-2 ng/μL. Furthermore, analysis of the 152 clinical specimens yielded a specificity ranging from 96.5%-100.0%, and a sensitivity of 100.0% for the 13 pathogens. Conclusion This study revealed that the MPCE assay is a rapid, reliable, and high-throughput method with high specificity and sensitivity. This assay has great potential in the molecular epidemiological survey of respiratory pathogens.     

Molecular analysis of Pasteurella multocida strains isolated from fowl cholera infection in backyard chickens

Objective

To characterize Pasteurella isolated from backyard chickens using whole cell protein lysate profiles and random amplified polymorphic DNA (RAPD) techniques to show their genetic relationship because Pasteurella multocida (P. multocida) is an important cause of fatal infections in backyard chickens.

Methods

Twenty one P. multocida isolates were recovered previously from clinical cases of fowl cholera belonging to individual owners and phenotypically analyzed using biochemical tests and serotyping were used for the genetic characterization.

Results

Phylogenetic study based on both methods revealed that the recovered population of P. multocida isolated from backyard chickens differs markedly, constituting a well-separated cluster and appearance of 3 distinguishing lineages with greater discrimination shown by RAPD-PCR that resulted in two suclusters in cluster A and three subclusters in cluster B and were related greatly with capsular serogroups for the examined strains. The whole cell protein revealed the presence of dominant protein bands at approximately 41 and 61 kDa in all of the examined isolates that may be a virulent proteins share in the increasing of its pathogenicity. Clear distinctive bands ranged from 123 to 1 554 bp.

Conclusions

Based on the previous findings, there are three spreading clusters that may indicate the association of a small number of P. multocida variants with the majority of cases suggesting that certain clones of P. multocida are able to colonize the examined backyard chickens. Also, the ease and rapidity of RAPD-PCR support the use of this technique as alternative to the more labour-intensive SDS-PAGE system for strain differentiation and epidemiological studies of avian P. multocida. Further application of RAPD technology to the examination of avian cholera outbreaks in commercially available flocks may facilitate more effective management of this disease by providing the potential to investigate correlations of P. multocida genotypes, to identify affiliations between bird types and bacterial genotypes, and to elucidate the role of specific bird species in disease transmission.     

基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S~23S r DNA IS、23S~5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的分布与耐药性分析

目的 了解耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的分布特点及其耐药性,为指导临床合理使用抗菌药物提供依据。方法 收集2014年1月至2017年12月临床分离的CRKP菌株,采用自动化仪器法和纸片扩散法（K-B法）对上述菌株进行药物敏感性试验,药物敏感性结果严格按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）和美国食品药品管理局（FDA）标准判定。采用WHONET软件和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。结果 共收集临床分离CRKP菌株403株,主要标本来源为痰/支气管肺泡灌洗液（169株,占41.9%）。CRKP首次分离标本来源不同,后续CRKP血流感染的发生率也不同,差异有统计学意义（P<0.05）。CRKP来源科室位列前3位的分别为烧伤重症监护病房（30.0%,121/403）、消化科（8.4%,34/403）和急诊重症监护病房（7.2%,29/403）。药物敏感性试验结果显示CRKP除对替加环素和磷霉素耐药率较低外,对其余抗生素的耐药率均>60.0%。结论 CRKP对多数常用抗生素呈现高度耐药。应加强对CRKP的耐药性监测,尤其是烧伤重症监护病房等重点科室,并采取有效措施预防和控制CRKP的传播。     

实验动物中沙门菌的实验室检测能力验证的结果与分析

目的 通过实验动物中沙门菌检测能力验证计划,了解实验动物检测机构对沙门菌的检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法 按照CNAS批准的能力验证方案,通过冷冻干燥法制备含有沙门菌及干扰菌的实验动物粪便样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,经冷链运输发放给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果 全国共有20个省市的30个实验室参加沙门菌能力验证项目,其中28个实验室获满意结果,占总参加机构的93.3%,不满意的2个实验室,占6.7%。采用分离培养方法的有29个实验室,采用PCR方法的有2个实验室。结论 实验动物质量检测机构沙门菌检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

实验动物金黄色葡萄球菌的实验室检测能力验证结果评价

目的 通过实施实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法 按照CNAS批准的能力验证方案,通过低温冻干制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果 共有28个实验室参加本次能力验证项目,其中获得满意验证结果的实验室为22个,占总参加机构的78.57%;未得到满意验证结果的实验室为6个,占21.43%。采用国标检测方法的有27个,采用PCR检测方法的有1个。结论 实验动物质量检测机构对金黄色葡萄球菌的检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。