兔抗猪Ⅱ型胶原抗血清的制备与检测

目的：采用纯化的猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔制备Ⅱ型胶原抗体,并经改良的ELISA法检测确定Ⅱ型胶原抗体效价。方法：提取猪Ⅱ型胶原,经层析纯化,将纯化无菌Ⅱ型胶原与不完全佛氏佐剂等量混合,注射于兔脚掌、背部和皮下。并每隔20天追加抗原刺激,共3次,每隔一定时间收集血浆,以ELISA法检测抗Ⅱ型胶原抗体。结果：提纯猪Ⅱ型胶原纯度与Sigma标准品一致。Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔,抗体含量具二个高峰期,分别在首次致敏后第21天和第40天,免疫第40天抗血清的效价达1：2430。结论：采用纯化猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔短期内可产生高效价抗体。     

兔抗猪Ⅱ型交原抗血清的制备与检测

目的 采用纯化的猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔制备Ⅱ型胶原抗体，并经改良的ＥＬＩＳＡ法检测确定Ⅱ型胶原抗体效价。方法 提取猪Ⅱ型胶原，经导析纯化，将纯化无菌Ⅱ型胶原与不完全佛氏佐剂等量混合，注射于兔脚掌、背部和皮下。并每隔２０天追加抗原刺激，共３次，每隔一定时间收集血浆，以ＥＬＩＳＡ法检测抗Ⅱ型胶原抗体。结果 提纯猪Ⅱ型胶原纯度与Ｓｉｇｍａ标准品一致。Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔，抗体抗量具有二个高峰期，     

人C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-1高特异性抗体的制备

目的 制备人补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白1（hCTRP1）的特异性抗体.方法 合成了hCTRP1的C端抗原肽并免疫新西兰大白兔,利用亲合纯化色谱柱对抗体进行了纯化.结果 间接ELISA测定表明,抗血清效价达1∶64 000,Western印迹及ELISA验证表明纯化抗体具有很高的特异性.结论 人工合成的hCTRP1抗原肽免疫新西兰大白兔,制备了高效价的抗血清,并纯化制备了hCTRP1特性抗体.     

增强型绿色荧光蛋白兔多克隆抗体的制备

目的:制备增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的兔多克隆抗体.方法:用谷胱甘肽-增强型绿色荧光蛋白(GST-EGFP)融合抗原加福氏完全佐剂背部皮内注射首次免疫新西兰大白兔,第28天用GST-EGFP融合抗原加福氏不完全佐剂同样剂量加强免疫,第35天时再次免疫.第49天心脏采血30 mL,4℃静置过夜,收集血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清中EGFP多克隆抗体的效价;免疫印迹法检测EGFP多克隆抗体的特异性;利用荧光免疫细胞化学检测该抗体和观察转染EGFP贴壁生长的大鼠脑皮层混合培养细胞中EGFP的表达.结果:ELISA检测EGFP多克隆抗体滴度最高为1:9 549;免疫印迹检测结果显示该抗体特异性高;荧光免疫细胞化学检测显示存混合培养细胞中EGFP呈阳性表达.结论:直接使用GST-EGFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,可在较短时间内制备大量EGFP多克隆抗体.     

人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体β基因(PILRβ)的克隆、表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体蛋白PILRβ,制备并鉴定其多克隆抗体.方法:应用RT-PCR从人的外周血细胞总RNA中反转录并扩增出PILRβ基因,将其克隆到表达载体pET-32a,在大肠杆菌中IPTG诱导表达,经Ni2 -NTA亲和层析柱纯化,纯化后的蛋白多次注射免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体特异性.结果:获得了较高纯度的PILRβ蛋白(Mr约为42 000)及其抗体,多抗效价达到1:10 000,且特异性较好.结论:成功克隆了PILRβ基因并表达纯化了其蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究PILRβ蛋白的功能和潜在的药物开发打下了基础.     

猪囊尾蚴cC1蛋白的原核表达及其特异性鸡卵黄抗体的制备与鉴定

目的 制备并鉴定特异性抗猪囊尾蚴鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),为猪囊尾蚴病的免疫学诊断提供新的途径.方法 原核表达猪囊尾蚴抗原cC1蛋白,纯化后经皮下和肌肉多点注射免疫25周产蛋海兰母鸡,200 μg/只,首次免疫28 d后加强免疫3次,每次间隔10 d.ELISA法检测IgY抗体效价,Akita法和EGGstractT...     

抗钩虫特异性卵黄抗体的制备与鉴定

目的 制备并鉴定特异性抗十二指肠钩虫鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),为分析抗钩虫IgY抗体的作用奠定基础.方法 制备十二指肠钩虫成虫粗抗原,经皮下和肌肉注射免疫25周产蛋海兰母鸡3次,每只鸡每次的免疫剂量为200 μg,初次免疫后28 d进行加强免疫,加强免疫间隔时间为10 d.水稀释法提取卵黄中的IgY,盐析、透析法纯化IgY,BCA法测定蛋白含量,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot分析.ELISA法动态检测抗体效价,观察抗体效价变化.结果 免疫后55 d的每个鸡蛋能提取40~55 mg IgY,经SDS-PAGE和Western blot分析,纯化的IgY有2条主带,分子量分别是35 ku和60 ku,即IgY的轻链和重链.初次免疫后10 d左右出现抗体,至免疫后50~55 d为高峰,效价达到1 ∶ 10 000以上.IgY与人血清抗体均可识别30 ku处钩虫抗原.结论 十二指肠钩虫成虫粗抗原免疫的海兰母鸡能产生高浓度、高效价、特异性的IgY抗体,为分析抗钩虫IgY抗体的作用奠定了基础.     

人心脏发育相关基因ZNF382的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化ZNF382融合蛋白及制备兔多克隆抗体.方法 通过PCR扩增ZNF382编码区,将其克隆到pRSET C载体中,重组载体酶切鉴定,测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,原核表达产物经鉴定、纯化后,免疫新西兰大白兔.通过ELISA和Western blot检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了pRSET C-ZNF382原核表达重组质粒,His6-ZNF382融合蛋白被强烈诱导表达,以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为 64×103,纯化后免疫产生的多克隆抗体效价约为1∶10 000,与ZNF382原核表达蛋白特异性结合.结论 获得了大量高效价、高特异性的兔抗人ZNF382多克隆抗体.     

抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定

目的：制备抗泡球蚴18（Em18）抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法：表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果：免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到最高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论：获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.     

小鼠在柯萨奇病毒A组16型活病毒免疫原性评价中的应用

目的 评价小鼠在柯萨奇病毒A组16型(CA16)活病毒感染中免疫原性的应用,为减毒活疫苗研究提供实验数据.方法 以不同剂量的CA16活病毒通过皮下、腹腔和肌肉途径接种不同年龄的ICR和BALB/c小鼠,采集初次免疫7d、21d、28d以及加强免疫7d后的血样;通过微量细胞病变中和法检测中和抗体效价,细胞因子ELISA检测试剂盒检测6种细胞因子含量.结果 初次免疫后28 d,肌肉、腹腔和皮下途径免疫的小鼠血清抗体阳转率分别为83.33％、40.00％和0.00％,抗体几何平均效价(GMT)分别为1∶169、1∶32和0;加强免疫后,肌肉、腹腔和皮下途径免疫的小鼠血清抗体阳转率均达100％,抗体GMT分别为1∶813、1∶609和1∶32,肌肉和腹腔途径免疫的小鼠血清抗体GMT平均增长4.8倍和19.0倍;加强免疫7d的抗体阳转率达100％;明显高于初次免疫28 d和21 d;BALB/c小鼠与ICR小鼠相比,前者的中和抗体效价和抗体阳转率明显高于后者,而小鼠年龄对中和抗体效价和抗体阳转率的影响不显著(P＞0.05);免疫剂量对中和抗体效价和抗体阳转率的影响显著(P＜.05),高剂量病毒免疫小鼠后中和抗体效价和抗体阳转率明显比低剂量高(P＜0.05);细胞因子检测结果显示加强免疫7d后的白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量与初次免疫7d的相比显著增加.结论 BALB/c和ICR小鼠可做为CA16活病毒免疫原性评价的动物模型,以4～6周龄的BALB/c小鼠最为敏感.     

九种重要经济动物二级抗体的制备和HRP标记

目的 制备兔抗9种重要经济动物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为经济动物血清学检测系统的建立提供工具.方法 利用饱和硫酸铵沉淀粗纯抗体后,再利用protein A或protein G 亲和层析的方法进一步纯化动物血清IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法纯化兔抗经济动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性.结果 纯化了家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～15000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性.结论 成功制备了HRP标记的兔抗9种重要经济动物的二级抗体,为经济动物血清学检测体系的建立提供了工具.     

可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定

目的 从猪膝关节软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定.方法 选择猪膝关节软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶两步消化、氯化钠盐析、超纯水透析、离心浓缩等方法提取纯化Ⅱ型胶原蛋白;采用SDS-PAGE、氨基酸成分分析对提取的Ⅱ型胶原蛋白进行鉴定;利用冻干的方法计算提取的浓度.结果 SDS-PAGE电泳结果...     

人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的：将以构建的未剪接型X盒结合蛋白1（XBP1u）的原核表达,纯化及人XBP1多克隆抗体的制备.方法：重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coliBL2l（DE3）,在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni2＋-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果：XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1∶64000,免疫印迹结果出现特异Mr33×103XBP1u条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论：成功表达和纯化人XBP1u蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.     

粉尘螨变应原Derf1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达、纯化粉尘螨主要变应原Der f1重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:大量诱导表达含pET-28a(+)-Der f1质粒的BL21菌株,SDS-PAGE电泳并割胶纯化目的蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔,收集血清进行效价检测并用Western blot检测其特异性。结果:割胶回收可有效纯化Der f1重组蛋白,抗Der f1抗体效价为1∶32 000。结论:成功制备Der f1多克隆抗体,以期为尘螨过敏性疾病的诊断和免疫治疗提供参考。     

奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶多克隆抗体的制备和鉴定

目的 表达、纯化奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶(PPK)蛋白,制备PPK多克隆抗体.方法 利用分子生物学软件分析奇异变形杆菌PPK的抗原性、疏水性等参数,选取N端较保守的309个氨基酸,并对其基因序列进行密码子优化以利于原核表达.合成新的基因序列后插入pET28b(+)质粒,转化入转化宿主菌BL21(DE3),诱导、表达融合蛋白.通过镍琼脂糖亲和层析技术,将获得的融合蛋白进行纯化.以纯化的蛋白作为免疫原并结合使用佐剂,背部多点注射新西兰大白兔,ELISA检测兔血清效价,Western Blotting验证抗体特异性.结果 成功构建了奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,可在0.5 mmol/L IPTG、37℃条件下获得较好的诱导、表达;利用镍柱纯化后的PPK蛋白与免疫佐剂一起,采用背部多点接种新西兰大白兔,制备了效价高的兔抗血清.ELISA检测血清效价达到1∶512 000,Western Blotting对ppk基因缺失株及其野生株进行验证显示抗体特异性良好.结论 利用pET28b(+)载体可构建奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,表达、纯化后的蛋白与佐剂共同免疫新西兰大白兔,可获得效价高、特异性良好的兔多克隆抗体血清,为奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶的检测以及深入研究PPK在奇异变形杆菌致病中的作用奠定了基础.     

流行性乙型脑炎病毒重组E蛋白的纯化及多克隆抗体制备

目的：纯化原核表达的JEV E蛋白并制备其多克隆抗体。方法：IPTG诱导大肠杆菌表达JEV E蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化。将纯化后的JEV E蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗血清。琼脂糖双向扩散实验及间接ELISA检测抗体效价。结果：获得浓度1.85mg/ml、纯度92%的JEV E蛋白,并制备了JEV E蛋白兔多克隆抗体血清。琼脂糖双向扩散实验显示多克隆抗体血清1∶16稀释时仍能观察到沉淀线,间接ELISA法显示1∶200稀释时具有较高效价。结论：纯化了JEV E蛋白,并制备出了多克隆抗体。     

猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的:构建猪LIF原核表达载体,表达并纯化重组猪LIF蛋白,制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位。方法:根据GenBank中猪LIFcDNA基因序列扩增出目的基因片段,将扩增的片段克隆进PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白,纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性;最后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位。结果:酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20000的位置上有明显的增强表达条带;纯化结果显示,重组蛋白在相对分子质量约20000的位置上有一条清晰、单一的条带;通过免疫新西兰大白兔,获得了特异性较高、效价达1∶10000的多克隆抗体;应用该抗体进行的免疫定位显示,LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。结论:重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达;得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体;LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。     

羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

目的 从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定.方法 选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后,用盐酸胍去除蛋白多糖,经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤,提取纯化蛋白,然后进行鉴定.结果 4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖,用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意;氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳.SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的蛋白与sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致.Ⅱ型胶原蛋白最大吸收峰为212 nm.结论 从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高,且符合Ⅱ型胶原蛋白的特征.     

猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的：构建猪LIF原核表达载体，表达并纯化重组猪LIF蛋白，制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位。 方法：根据GenBank中猪LIF cDNA基因序列扩增出目的基因片段，将扩增的片段克隆进 PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，经转化使其在大肠杆菌BL21中表达，产生重组猪LIF蛋白，纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体；经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性；最后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位。结果：酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列；表达结果显示，诱导样品在相对分子质量约20 000的位置上有明显的增强表达条带；纯化结果显示，重组蛋白在相对分子质量约20 000的位置上有一条清晰、单一的条带；通过免疫新西兰大白兔，获得了特异性较高、效价达1∶10 000的多克隆抗体；应用该抗体进行的免疫定位显示，LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。结论：重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达；得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体；LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。     

辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的表达与多克隆抗体制备

目的：制备辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶（NRDR）多克隆抗体.方法：应用大肠杆菌BL21-AI表达NRDR,制备NRDR包涵体,使用从SDS-PAGE凝胶中回收的重组NRDR作为免疫原,采用肩胛骨下注射作为免疫途径免疫兔.斑点杂交测定抗血清效价,HiTrap Protein G柱纯化兔IgG,免疫印迹鉴定抗体特异性.结果：BL21-AI对NRDR进行了高效表达.回收的NRDR蛋白溶液的浓度为0.36mg/ml,回收率为48.5%.所有免疫的动物在第2次追加免疫之后都产生了高效价的抗血清,血清的效价是1：500,检测极限是8ng NRDR蛋白.纯化后的NRDR抗体具有较高的免疫活性和特异性.结论：建立了高效制备辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶多克隆抗体的方法.