基础医学研究生科研能力培养的现状和建议

科研能力的培养是研究生教育与本科教育的重要区别。对毕业后专职从事科研教育事业的基础医学研究生来说尤其具有重要的意义。在此分析了当前研究生科研能力培养中存在的问题,提出了相应的解决对策。     

重庆地区汉族人群TRB3基因+251A/G多态性与多囊卵巢综合征的相关性分析

目的了解中国重庆地区汉族人群TRB3基因外显子+251A/G的基因型分布,探讨该基因多态性与多囊卵巢综合征(PCOS)及其糖脂代谢、胰岛素抵抗等的相关性。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对139例PCOS患者和120例正常对照者TRB3基因第2外显子+251A/G位点进行基因分型,同时进行人体测量学及代谢指标的检测,并对其中的107例PCOS患者和20例正常对照行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验。结果 TRB3基因+251A/G多态性位点的3种基因型AA、AG、GG频率在PCOS组中分别为62.59%、33.09%、4.32%,与对照组(60.83%、36.67%、2.5%)相比,差异无统计学意义(χ2=0.88,P=0.64)。PCOS组和对照组等位基因频率分布差异亦无统计学意义(P=0.99)。PCOS组AG/GG基因型的LDL-c和HDL-c水平明显低于AA基因型(P=0.028,P=0.036)。结论 TRB3基因+251A/G多态性与重庆地区汉族人群多囊卵巢综合征的发生无关,但可能与PCOS患者血脂代谢紊乱有关。     

携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。     

稳定表达HBx的HepG2细胞对罗格列酮敏感性的影响及其机制研究

目的：构建稳定表达x基因编码的乙型肝炎病毒x蛋白（x protein of hepatitis B virus，HBx）的HepG2细胞，检测其对罗格列酮敏感性的变化，并探讨HBx与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ）之间的相互作用在原发性肝癌形成过程中的可能机制。方法：构建plRES2-HBx真核表达质粒，筛选稳定表达HBx的HepG2细胞；MTT法检测细胞对罗格列酮的敏感性；免疫细胞化学法检测PPARγ定位的变化；RT—PCR和Western印迹法检测PPART的表达。结果：成功构建pIRES2-HBx真核表达质粒，获得稳定表达HBx的HepG2细胞；罗格列酮对该细胞的抑制作用明显降低（P〈0．05），经丝裂原活化蛋白激酶／细胞外信号调节激酶的激酶1（mitogen-activated protein kinase／extra-cellular signalregulated kinase kinase 1，MEK1）抑制剂PD98059预处理后，抑制率有所回升；PPARγ表达量变化的差异无统计学意义，但在细胞中的表达位置发生改变，即从细胞核转至细胞质。结论：HBx可降低HepG2细胞对罗格列酮的敏感性，可能的机制是HBx可改变PPARγ在细胞内的定位以及与DNA的结合能力．并通过磷酸化狳径影响PPARγ与配体的结合能力及其活性。     

乳腺癌拉帕替尼耐药模型建立及二甲双胍逆转其耐药性的初步探讨

目的：建立乳腺癌拉帕替尼耐药模型并初步探讨二甲双胍对其耐药性的逆转作用。方法：体外建立乳腺癌拉帕替尼耐药模型;实验分为亲本组、空白耐药组、拉帕替尼组二甲双胍组和联合用药组（n=3）;CCK-8法检测并计算空白耐药组细胞耐药倍数及二甲双胍组细胞逆转耐药倍数;流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测各组细胞凋亡率和周期;Western blot检测各组细胞PI3K信号通路相关蛋白的表达水平。结果：空白耐药组细胞对拉帕替尼敏感性降低;亲本组、空白耐药组及二甲双胍组细胞IC50值分别为（2.64±0.12）、（11.21±0.03）、（5.62±0.13） μmol/L,耐药倍数约为4.25,逆转耐药倍数约为2.0;二甲双胍组（0.73±0.04）细胞增殖指数较空白耐药组（1.11±0.02）明显降低（P=0.004）,联合用药组（0.63±0.06）细胞增殖指数较空白耐药组（1.11±0.02）同样明显降低（P=0.031）;二甲双胍组[（10.70±0.76）%]细胞凋亡率较空白耐药组[（5.05±0.59）%]明显增高（P=0.007）,联合用药组[（24.68±1.52）%]细胞凋亡率较空白耐药组[（5.05±0.59）%]同样明显增高（P=0.006）;联合用药组中PI3K信号通路相关磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白表达较空白耐药组均下降。结论：成功建立乳腺癌拉帕替尼耐药模型;二甲双胍通过抑制PI3K信号通路逆转乳腺癌拉帕替尼耐药性。     

NOGGIN基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞系增殖和侵袭的影响及机制

目的 基因对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭能力的影响,并初步探讨其机制.方法 表达NOGGIN方法以NOGGIN重组腺病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,MTT法检测细胞增殖能力,划痕修复实验及Transwell细胞侵袭实验检测其运动和侵袭能力,定量RT-PCR和总蛋白Western blot检测CXC...     

乙肝病毒X蛋白对肝前体细胞分化的影响

目的：检测乙肝病毒X（Hepatitis B virus X,HBx）蛋白对肝前体细胞分化的影响,以探讨HBx蛋白能否促进肝干细胞的恶性转化。方法：以腺病毒Ad-HBx和Ａd-GFP感染肝前体细胞株Hp14-19,RT-PCR和Western blot证实HBx蛋白在肝前体细胞内的表达。RT-qPCR和免疫荧光检测早期和晚期分化指标的变化,并于诱导后11 d用PAS染色观察细胞的分化成熟程度。结果：Ad-HBx能有效感染肝前体细胞株Hp14-19并表达。与对照组（感染Ad-GFP）相比,实验组（感染Ad-HBx）细胞分化早期指标穿膜蛋白（Delta like homolog,DLK）、肌酸激酶19（Creatine kinase19,CK19）和甲胎蛋白（Alpha fetal protein,AFP）表达降低减慢,而晚期指标CK18和白蛋白（Albumin,ALB）表达升高不明显。PAS染色阳性率降低。差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：HBx可抑制肝前体细胞的分化,这可能是最终导致肝前体细胞恶性转化的原因之一。     

过表达Wnt3基因抑制肝前体细胞凋亡

目的利用腺病毒载体转染体外培养的肝前体细胞,研究过表达Wnt3对肝前体细胞凋亡的影响。方法用携带Wnt3的腺
病毒载体（Ad-Wnt3）转染肝前体细胞,同时设立空载体腺病毒转染组（Ad-GFP）为对照。转染72 h 后,用荧光显微镜观察
Hoechst33342 染色后细胞凋亡情况;流式细胞术检测Annexin-PE/7-ADD法标记的细胞凋亡率;RT-PCR和Western blot分别检
测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平。结果qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3在肝前体
细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3能高效转染肝前体细胞。与对照组相比较,肝前体细胞转染Wnt3后,肝前体细胞的
凋亡水平明显下降,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。Bax的mRNA及蛋白表达水平
则明显下降（P<0.05）。结论在肝前体细胞中,Wnt3基因过表达能抑制肝前体细胞凋亡,其机制可能是通过Bcl-2家族起作用。     

Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响

目的 探讨Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响.方法 将细胞分为4组:阴性对照组(即空白组)、实验对照组(感染Ad-GFP组)、阳性对照组(50 ng/ml RANKL诱导组)、实验组(感染Ad-Wnt3a组).分别给予处理因素后常规细胞培养6d,通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞的分化成熟情况;Western blot检测TRAP、Cathepsin K蛋白的表达;分别于处理因素后3、6、9d提取细胞总RNA,荧光定量Real time (RT-PCR)检测核因子κB受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的表达.结果 TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导RAW 264.7成多核(核≥10),空白组和Ad-GFP组有少量多核细胞(3≤核≤5),Ad-Wnt3a组为单核有个别双核;Western blot检测显示Ad-Wnt3a组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P＜ 0.05);RT-PCR检测Ad-Wnt3a组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K、MMP-9基因的表达.结论 Wnt3a能抑制RAW264.7分化成成熟的破骨细胞.     

ALB启动子基因报告质粒的构建及VEGF对肝前体细胞诱导分化作用的初步研究

目的:构建白蛋白(ALB)启动子调控的荧光素酶报告质粒,以方便检测ALB的表达.并用该方法初步检测血管内皮生长因子(VEGF)对肝前体细胞分化诱导的影响.方法:PCR扩增ALB的启动子及增强子片段,插入pBGLuc载体,构建pBGLuc-ALB荧光素酶报告质粒,并经经酶切、测序及荧光素酶活性检测验证.包装成逆转录病毒感染肝前体细胞株E14.5d,构建稳定细胞株E14.5-ALB-LUC.以重组腺病毒载体Ad-VEGF感染E14.5-ALB-LUC细胞株,通过荧光素酶活性检测观察其分化程度,并用RT-PCR、PAS染色验证其结果.结果:构建pBGLuc-ALB重组质粒,经酶切、测序及荧光素酶活性检测证实其正确效性.建立稳定细胞株E14.5-ALB-LUC.Ad-VEGF感染后,与对照组相比,荧光素酶的表达明显升高.RT-PCR证实肝前体细胞分化早期指标DLK,CK19降低,晚期指标ALB升高.PAS染色可见阳性细胞明显增加.结论:成功构建pBGLuc-ALB荧光素酶报告质粒,为进一步研究肝前体细胞分化打下基础,并在此基础上发现VEGF能诱导肝前体细胞分化为类肝细胞.