乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达TLR3的影响

目的 乙肝病毒全基因组体外扩增,构建质粒并测序,酶切后瞬时转染HePG2细胞,观察对HBV抗原分泌,病原识别受体Toll样受体3(TLR3)的表达及细胞增殖的影响.方法 长片段PCR法扩增HBV DNA全长,构建pBlueScript-HBV质粒并转化宿主菌,摇菌后提取质粒经测序,用Sap Ⅰ酶切,获得HBV 3.2 kb基因组,采用脂质体瞬时转染HepG2细胞株,IMX检测HBV所分泌抗原,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR3的阳性细胞百分率,并与空白对照组对比.结果 HBsAg和HBeAg的分泌随着转染HBV DNA量的增加而升高,除4 μg和6 μg组两组间比较的表面抗原外,差异均有显著性(P＜0.05).TLR3在转染后均有上调,除4 μg与6 μg组间比较外,各组间差异有显著性(P＜0.05).台盼蓝拒染法示细胞存活随转染剂量的升高而减少(P＜0.05),但4 μg和6 μg两组间比较差异无显著意义(P＞0.05).而各转染剂量组HBsAg和e抗原的分泌及细胞的存活数均与TLR3的表达呈显著正相关(P＜0.01).结论 本研究初步表明乙肝病毒可能直接引起HepG2细胞TLR3的上调,而且上调可能启动了细胞的凋亡或坏死机制,成为HBV损伤细胞的非免疫细胞介导机制.     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达TLR4的影响

目的探讨乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达Toll样受体4（Toll—likereee-ptor4，ⅡR4）的影响。方法采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2、HepG2-X和HepG2．2．15上表达的平均荧光强度及阳性细胞率，采用荧光定量PCR检测三种细胞TLR4的mRNA水平。结果肝癌细胞株HepG2．2．15上TLR4表达的平均荧光强度及阳性细胞率分别为（18．24±8．18）、（17．79±9．46）％，TLR4mRNA水平为（0．62±0．11），明显高于HepG2-X和HepG2细胞的相应值（P’〈0．001），而HepG2和HepG2-X两者之间的表达则无统计学差异（P〉0．05）。结论乙型肝炎病毒可直接上调细胞TLR4的表达，这种上调是通过乙型肝炎病毒非X基因或蛋白来完成的。     

黄芪提取物对乙型肝炎病毒抗原表达的抑制作用

目的探讨黄芪提取物对乙型肝炎病毒（HBV）病毒抗原表达的抑制作用。方法用MTT法测定黄芪提取液在不同浓度下对HepG2．2．15细胞的细胞毒性,ELISA法检测黄芪提取物对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg颗粒的影响。结果黄芪提取物对HepG2．2．15细胞4d和8d的半数毒性浓度（TC50）分别为88．914μg／ml和85．209μg／ml（P〉0．05）,对HBeAg4d和8d的治疗指数（TI）分别为1．018和1．342（P〉0．05）,对HBsAg4d和8d的治疗指数分别为0．065和0．089（P〉0．05）。结论黄芪提取物抑制HepG2．2．15细胞分泌HBeAg的作用为低效有毒,黄芪提取物对HBsAg抗原分泌无明显抑制作用。     

甘草甜素对HepG2.2.15细胞株HBeAg水平及TLR4表达的影响

目的 探讨甘草甜素(GL)时HepG2.2.15细胞上清HBeAg分泌,Toll样受体4(TLR 4)信号分子的表达及对细胞增殖的影响.方法 实时荧光定量PCR检测TLR4表达;直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR4的阳性细胞率;ELASA检测HBV所分泌抗原;MTT检测细胞增殖活性,并与空白对照组比较.结果 给药后HBV e抗原(HBeAg)的分泌结果显示,总体均数间差异显著(P<0.05),但甘草甜素各组与对照组比较差异无统计学意义;GL各组TLR4 mRNA及流式细胞TLR4的表达总体均数间均有显著差异(P<0.01),分别与对照组相比差异有显著性(P<0.01),100μg/mL组尤其明显;MTT实验显示,200μg/mL缸以下三个剂量组均可促进细胞增殖,50μg/mL组与对照组间差异显著(P<0.05);400μg/mL、800μg/mL两组均显著抑制细胞增殖(P<0.01);而MTT结果与HBeAg水平呈显著负相关(P<0.01),与TLR4表达无相关关系(P>0.05.结论 研究表明,甘草甜素对HepG2.2.15的e抗原分泌可能具有双向作用;细胞的存活率与e抗原呈负相关;TLR4在HepG2.2.15细胞株低表达,GL可上调TLR 4表达,甘草甜素可影响先天免疫中的TLR4信号分子,有可能在体内通过免疫途径影响HBV复制和抗原分泌.     

干预协同刺激信号对反复自然流产患者Th1/Th2转换影响的体外研究

目的 探讨干预协同刺激信号对反复自然流产患者Th1／Th2转换的影响。方法 用人绒毛膜癌细胞株JEG-3制备滋养细胞抗原；用该抗原刺激反复自然流产患者外周血单个核细胞，并分为两组：实验组加入细胞毒性T细胞相关抗导4（CTLA4Ig，10μg／mL组和1μg／mL组），对照组加IgG（10μg／mL组和1μg／mL组），培养72h，分别取24h和72h上清液，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测上清液中白介素2（IL-2）、干扰素γ（IFN-γ）和白介索4（IL-4）的水平。结果 与同质量浓度的对照组相比，CTLA4Ig组产生的IL-4水平明显高于对照组（P〈0．05），而产生的IL-2水平明显低于对照组（P〈0．05），IFN-γ水平两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。与CTLA4Ig1μg／mL组相比，CTLA4Ig10μg／mL组产生的IL-4水平明显升高（P〈0．05），IL-2水平明显降低（P〈0．05），IFN-γ水平两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 CTLA4Ig能通过阻断CD80／CD86共刺激信号，使反复自然流产患者Th1／Th2细胞因子向Th2型细胞因子偏移。     

TLR2和TLR4在大鼠光滑念珠菌肺部感染中的表达及意义

目的：研究Toll样受体2（TLR2）和TLR4在光滑念珠菌肺部感染大鼠中的作用。方法将36只大鼠分为3组,每组12只：对照组（A组）、未免疫抑制肺部光滑念珠菌感染组（B组）及免疫抑制肺部光滑念珠菌感染组（C组）。每组分别在造模成功后第1、3天各处死大鼠6只,观察肺组织病理变化,用逆转录PCR（RT-PCR）法检测肺组织 TLR2、TLR4 mRNA的表达、酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定TNF-α蛋白水平。结果 A组肺组织正常;B组部分肺泡塌陷、炎症细胞浸润,未见孢子或菌丝;C组大部分肺泡塌陷,部分扩张,大量炎症细胞浸润、并有孢子菌丝聚积。第1、3天 TLR2 mRNA和 TNF-α蛋白表达水平C组明显高于其他两组（P＜0．01）,B组高于A组（P＜0．05）;C组第3天 TLR2、TLR4 mRNA ,TNF-α表达水平高于第1天（P＜0．05,P＜0．01）,且TLR4表达高于A组（P＜0．05）。结论 TLR2和 TNF-α可能参与光滑念珠菌肺部感染的发生发展,TLR4可能起协同作用。     

白术茯苓等比配伍对脾气虚克罗恩病大鼠肠“神经-免疫”相关递质、Thl／Th2型细胞因子及TLR4／NF—KB的影响

目的考察白术茯苓等比配伍不同剂量组对脾气虚克罗恩病大鼠肠“神经-免疫”相关递质、Th1／Th2型细胞因子及TLR4／NF-KB的影响;初步探讨该方等比配伍治疗脾气虚CD的量效关系。方法采用破气耗气加饥饱失常法结合Morris方法复制脾气虚CD大鼠模型,以白术茯苓汤等比配伍高、中、低剂量灌胃给药。采用免疫组化方法检测VIP、VIPRl、SP与NK-1R;ELISA法测定TNF-d、IL-lB、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10;Real-timePCR法检测TLR4mRNA和NF-KBp65mRNA。结果①模型组TNF-a、IL-1B、IL-6、IL-8水平明显增高（P〈0．05）;高剂量组可明显降低TNF-a、IL-lB、IL-8水平（P〈0．05）;中剂量组可显著降低TNF-a、IL-1B、IL-6、IL-8水平（P〈0．05）;低剂量组可明显降低TNF-n含量（P〈0．05）。②模型组IL-4、IL-10水平明显降低（P〈0．05）;高剂量组可明显恢复IL-4水平（P〈0．05）;中剂量组可显著增加IL-4、IL-10含量（P〈0．05）;低剂量组对IL-4、IL-10影响不明显。③模型组VIP、VIPRl、SP与NK-IR明显升高（P〈0．05）;高剂量组可明显降低VIP、VIPRl（P〈0．05）;中剂量组可显著减少VIP、VIPRl、sP与NK-IR（P〈0．05）;低剂量组对VIP、VIPRl、SP与NK-IR影响不明显。④模型组TLR4mRNA和NF-KBp65mRNA含量明显升高（P〈0．05）;中剂量组可明显降低rrLR4mRNA和NF-KBp65mRNA含量（P〈0．05）;高、低剂量组对TLR4mRNA和NF-KBp65mRNA影响不显著。结论白术茯苓汤等比配伍中剂量组能显著调节脾气虚克罗恩病大鼠肠“神经-免疫”相关递质、r1111／1112型细胞因子及TLR4／NF-KB通路．发挥治疗CD的作用．     

TLR2和TLR4在生殖器疱疹患者外周血白细胞上的表达

目的探讨Toll样受体2和4（Toll—likereceptor,TLR2、TLR4）的表达在生殖器疱疹发病机制中的作用。方法采用流式细胞术检测32例生殖器疱疹患者及22例正常人外周血淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表面TLR2和TLR4的表达。结果TLR2和TLR4在外周血单核细胞上的表达相对较高,而在淋巴细胞和粒细胞上的阳性率平均值均低于5％;患者和对照组相比,各细胞表面TLR2的表达水平无显著差异（P＞0．05）,TLR4在两组淋巴细胞上表达水平无显著差异（P＞0．05）,患者TLR4在单核细胞上的表达水平为（18．49％±10．01）％。显著高于对照组（8．02％±5．37）％（P〈0．001）;患者TLR4在粒细胞细胞上的表达水平为（1．90％±1．46）％,比对照组的（0．45％±0．25）％明显升高（P〈0．001）。结论单核细胞和粒细胞表面的TLR4在对病毒识别、增强特畀陡的信号传导、启动抗病毒的固有免癌反应中起着重要作用。     

活性氧（ROS）在三氧化二砷诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡中的作用

目的：利用Mn（Ⅲ）TBAP能特异性清除细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）,观察不同浓度三氧化二砷（As2O3）单独和联合Mn（Ⅲ）TBAP作用于人肝癌HepG2细胞后细胞内活性氧（ROS）的变化和对凋亡的影响,探讨活性氧（ROS）在三氧化二砷（As2O3）诱导肝癌细胞株HepG2凋亡中的作用。方法：实验分3组：对照组,不同浓度三氧化二砷（As2O3）组,三氧化二砷（As2O3）＋Mn（Ⅲ）TBAP组。用四甲基偶氮唑盐（MTr）比色法测定细胞生长增殖活性;激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内ROS的变化;AnnexinV／PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：2、4、8μol／L三氧化二砷（As2O3）处理HepG2细胞后各组细胞增殖抑制率高于对照组（P〈0．05）,细胞增殖抑制率随As2O3浓度的增加及作用时间的延长而升高（P〈0．05）;HepG2细胞内ROS的水平随As2O3浓度的增加而升高（P〈0．05）,As2O3处理组HepG2细胞内ROS水平高于空白对照组（P〈0．05）,As2O3＋Mn（Ⅲ）TBAP组HepG2细胞内ROS的水平低于As2O3组（P〈0．05）,但高于对照组（P〈0．05）。细胞早期凋亡率随As2O3浓度的增加及作用时间的延长而升高（P〈0．05）,且均高于Mn（Ⅲ）TBAP＋As2O3组和对照组,Mn（Ⅲ）TBAP＋As2O3组高于对照组。结论：三氧化二砷作用于HepG2细胞促进了细胞内ROS的产生,ROS水平的提高增加了三氧化二砷促HepG2细胞凋亡的敏感性。     

重楼提取物对HepG2细胞的毒性作用

目的 研究重楼提取物对肝癌HepG2细胞的毒性作用及其机制。方法 应用锥虫蓝拒染法测定不同浓度重楼提取物作用不同时间后对HepG2细胞存活率的影响。通过倒胃相差显微镜、透射电镜及苏木精-伊红染色后光镜观察重楼提取物对HepG2细胞形态学的影响。通过碘化丙啶染色法及流式细胞术对重楼提取物是否诱导细胞凋亡进行验证。结果 各浓度重楼提取物都对肝癌HepG2细胞有一定的杀伤作用．浓度越高、作用时间越长，其杀伤作用越强；与阳性对照组（FT-207）相比，62．5、125μg／ml重楼提取物对HepG2细胞的杀伤作用较弱（P〈0．01．P〈0．05）．而250、500μg／ml重楼提取物的杀伤作用与其相当（P〉0．05）．1000、2000μg/ml重楼提取物的杀伤作用则明显较高（均P〈0．01）。重楼提取物作用后的HepG2细胞呈现变性坏死的形态学改变。流式细胞仪检测结果显示不同浓度重楼组与阴性对照组凋亡率无明显差异（P〉0．05）。结论 重楼提取物具有细胞毒性作用。重楼提取物可能不是通过诱导细胞凋亡．而是通过导致癌细胞的变性坏死发挥其抗癌作用。     

TLR2与TLR4在大肠癌组织中的表达特点

目的 观察Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)在大肠癌组织和大肠癌细胞株上的表达特点.方法 采用SP免疫组化法检测70例大肠癌组织和配对癌旁相对正常组织TLR2,TL4的表达,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR2,TLR4在大肠癌细胞株Lovo和SW480细胞上表达的平均荧光强度及阳性细胞率.结果 TLR2在大肠癌组织上的表达明显强于癌旁组织(X2=13.629,P=0.003),而TLR4的表达在大肠癌组织与癌旁组织差异元显著性(P＞0.05).根据平均荧光强度及阳性细胞率,TLR2,TLR4在大肠癌细胞株Lovo和SW480上基本无表达.结论 TLR2可能与大肠癌的疾病过程密切相关.     

Toll样受体4介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒的复制

目的探讨Toll样受体4（TLR4）介导的天然免疫对Bewo细胞中乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法首先用TLR4配体LPS处理Bewo细胞,观察细胞TLR4 mRNA表达的动力学。然后将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1（＋）-HBV1.3转染Bewo细胞,12h后,以LPS处理3d。最后,用抗TLR4处理Bewo细胞1h后,加入10μg/ml LPS刺激。采用荧光定量RT-PCR、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测细胞TLR4 mRNA表达、HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平。结果 LPS可显著诱导Bewo细胞TLR4 mRNA表达（P〈0.05）,呈时间和剂量依赖性;与对照组比较,LPS可显著抑制HBV复制（P〈0.001）,LPS对HBV DNA、HBsAg及HBeAg的抑制率（%）分别为29.70±6.03、32.12±5.98和33.89±1.28。抗TLR4可显著逆转LPS对HBV复制的抑制作用（P〈0.01）。结论 TLR4介导的天然免疫可一定程度地抑制Bewo细胞中HBV复制,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。     

TLR7配体Loxoribine抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的 探讨TLR7配体Loxoribine对乙型肝炎病毒的抑制作用。方法 采用MTT法观察Loxoribine药物对体外培养HepG2.2.15细胞的毒性作用,ELISA及荧光定量PCR法分析药物对细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的影响。结果 低浓度Loxoribine对体外培养的HepG2.2.15细胞生长有一定抑制作用,但随着药物浓度增高,对细胞生长并无明显毒性作用。Loxoribine可有效地抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA的复制及HBsAg的分泌,并随着药物浓度的增加和作用时间的延长,对HBsAg抑制率增大,而对HBeAg的分泌无抑制作用。结论 Loxoribine在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用。     

乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表达及其意义

目的 检测乙肝患者血清标本中TLR2和TLR4的含量,关注其表达特征,探讨其表达的意义.方法 本实验以130例乙肝患者的血清标本作为观察组,60例正常体检成人的血清标本作为对照组,应用酶联免疫吸附实验检测二组中TLR2和TLR4的表达,分析其在不同临床病理特征之间意义及相互关系.结果 乙肝患者血清中TLR2和TLR4的表达明显高于对照组[(85.46±15.46) ng/L vs (28.75±2.35) ng/L;(100.23±23.25) ng/L vs (64.34±4.32) ng/L],血清中TLR2和TLR4的含量与乙肝患者病情的严重程度有关,乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表达呈正相关(P=0.021 4,r=0.39).结论 乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4高表达,二者可能具有协同作用.联合检测血清中TLR2和TLR4的含量可能与判断病情的严重程度有关.     

乙肝病毒携带者PBMC细胞中Toll样受体2表达水平与乙肝病毒增殖相关性研究

目的：探讨乙肝病毒（HBV）增殖与无症状乙肝病毒携带者（ASC）外周血中Toll样受体2（TLR2）表达水平的相关性。方法：分离乙肝病毒携带者和健康志愿者外周血单个核细胞,分别用免疫细胞化学染色方法检测TLR2在细胞表面的表达情况;用RT-PCR方法检测TLR2的mRNA水平;用ELISA法检测乙肝病毒携带者和健康志愿者血清中TLR2活化后产物TNF-α的表达水平。结果：HBV复制活跃组的外周血单个核细胞中TLR2在蛋白水平和mRNA水平表达明显低于HBV复制不活跃组和健康对照组;HBV复制活跃组血清中TNF-α水平显著低于HBV复制不活跃组。结论：乙肝病毒携带者外周血单个核细胞TLR2的表达及活化与乙肝病毒的增殖有相关性。     

臭氧溶液对HBV体外感染的HepG2细胞的抗病毒作用

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)体外感染人肝癌HepG2细胞的实验模型,并研究臭氧溶液对感染了HBV后的HepG2细胞的抗病毒作用。方法:乙肝阳性血清与HepG2细胞共孵育建立体外感染模型,采用倒置相差显微镜检测细胞形态,MTT法检测细胞成活率,ELISA法检测HBsAg和HBeAg表达水平,HBV荧光定量PCR检测HBV DNA表达量。结果:体外感染了HBV DNA的HepG2细胞能持续稳定分泌HBsAg和HBeAg,并能产生HBV DNA,通过低浓度臭氧溶液作用后,细胞形态无明显差异,细胞成活率无明显影响(P>0.05),HBsAg和HBeAg均转阴(P<0.01),HBV DNA拷贝量亦明显降低(P<0.01)。结论:较低浓度臭氧溶液对感染了HBV的HepG2细胞有明显的抗病毒作用,对细胞并无损伤。     

白细胞介素－32对 HepG22．15细胞 HBV表达的影响

目的：探讨白细胞介素－32（IL－32）对HepG22．15细胞HBV表达的影响。方法不同浓度的IL－32（0～0．8μg／mL）蛋白质加入HepG22．15细胞（插入HBV全基因组,持续表达）培养液共培养,48 h后收集培养上清液。用实时荧光定量PCR检测HBV DNA载量,用ELISA检测HBsAg、HBeAg表达水平。结果 IL－32抑制HepG22．15细胞HBV的复制,抑制HBsAg、HBeAg表达,且其抑制呈剂量依赖性增强。结论 IL－32可以抑制HepG22．15细胞HBV的表达,IL－32具有抗HBV的作用。     

TLR2在慢性乙肝孕妇胎盘中的表达及与宫内感染的关系

目的：探讨Toll样受体2（ TLR2）在慢性乙肝孕妇胎盘中的表达及与宫内感染的关系。方法选择HBsAg阳性的慢性乙肝孕妇80例,其中HBeAg阳性组40例,HBeAg阴性组40例,选择同期在我院分娩的正常孕妇20例为对照组,采用ELISA法检测孕妇外周血HBV血清标志物,采用蛋白印迹法检测TLR2分别在3组胎盘中的表达水平,荧光定量PCR法检测3组胎盘中HBV-DNA含量,同时采用ELISA法检测其分娩的新生儿外周血HBsAg,记录新生儿宫内感染率。结果 TLR2在对照组、HBeAg阴性组、HBeAg阳性组孕妇胎盘中表达逐渐降低,组间比较差异均有统计学意义（P＜0．05）,胎盘HBV感染率在对照组、HBeAg阴性组、HBeAg阳性组逐渐升高,组间比较差异均有统计学意义（P＜0．05）,新生儿HBV宫内感染率在对照组、HBeAg阴性组、HBeAg阳性组逐渐升高,组间比较差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论TLR2可能参与了胎盘感染HBV过程,并与HBV宫内感染有着密切的联系。     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.