IL-18联合IL-2诱导NK92细胞的实验研究

目的：探讨白细胞介素18（IL 18）联合白细胞介素2（IL 2）对自然杀伤细胞系NK92抗卵巢肿瘤作用的影响。方法：用不同浓度的IL 18联合IL 2（5?U/ml）体外诱导刺激NK92细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化。乳酸脱氢酶释放试验观察刺激前后NK92细胞及培养上清对SKOV3体外生长的抑制作用。ELISA测定NK92细胞杀伤活性最大时IFN γ、TNF α含量。结果：IL 18（25?ng/ml）+IL 2（5?U/ml）刺激后的NK92细胞与对照组比较,S期细胞增多,G0/G1期减少（P＜0.05）。效靶比为10∶1时,诱导后NK92细胞对SKOV3细胞作用4?h杀伤活性最高,IL 18+IL 2刺激前后的NK92细胞杀伤率分别为（42.3±4.82）%、（77.63±5.27）%。NK92培养上清36?h对SKOV3杀伤作用达到最高峰,刺激前后上清杀伤率分别为（21.2±3.49）%、（37.14±2.69）%。NK92细胞杀伤活性最大时,上清中IFN γ、TNF α水平明显升高（P＜0.05）。结论：IL 18联合IL 2可提高NK92细胞的抗肿瘤活性,为临床应用NK92细胞免疫治疗卵巢肿瘤提供了实验依据。     

荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法检测CAR⁃T细胞杀伤的方法学研究

目的：比较荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法两种杀伤实验方法在嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor?T,CAR?T）细胞针对不同性质靶细胞开展杀伤实验时的适用性。方法：针对两种不同性质的靶细胞（悬浮细胞和贴壁细胞）,采用荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法开展CAR?T细胞的杀伤实验,比较实验结果的精确性和趋势的一致性。结果：荧光染料双染流式法在靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验中能检测到具有统计意义的显著杀伤（P < 0.01）,但在靶细胞为贴壁细胞的实验中差异不显著;萤火虫荧光素酶法在悬浮和贴壁两种靶细胞的杀伤实验中都能检测到显著的杀伤（P < 0.01）。结论：荧光染料双染流式法更适合靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验,而萤火虫荧光素酶法对悬浮细胞和贴壁细胞都适合,因此在具体应用过程中应注意区别对待。     

曲古抑菌素A对外周血自然杀伤细胞活性和功能的影响

目的探讨曲古抑菌素A（TSA）对正常人外周血自然杀伤细胞(NK)活性和功能的影响。方法从正常人外周血单个核细胞（PBMCs）分离淋巴细胞（PBLs）（主要包括T细胞和NK细胞）或纯化NK细胞。体外应用白介素 2（IL 2）诱导PBLs 72?h产生淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞。将PBLs, LAK或NK细胞进行体外培养,给予不同浓度的TSA处理12、24、48?h。流式细胞术检测NK细胞和T细胞的凋亡;采用51Cr释放试验检测NK细胞的杀伤功能。结果TSA以剂量和时间依赖方式诱导PBLs和LAK细胞凋亡,TSA处理组淋巴细胞及LAK细胞凋亡百分率明显高于对照组（P＜0.05）;TSA同样可诱导静止期NK细胞的凋亡,0.1?μmol/L TSA作用于NK细胞24?h后,36%NK细胞凋亡,显著高于未处理组（P＜0.05）;0.1?μmol/L TSA作用于NK细胞１2?h后,其杀伤白血病细胞的能力明显低于对照组（P＜0.01）。结论TSA能够诱导人外周血静止期NK细胞及LAK细胞发生凋亡,并影响NK细胞的细胞毒作用。     

可溶性组织相容性抗原-G1抑制人自然杀伤细胞释放穿孔素颗粒酶介导异种排斥反应

目的：研究可溶性组织相容性抗原-G1（sHLA-G1）抑制人自然杀伤细胞（NK细胞）释放穿孔素、颗粒酶，从而降低人NK细胞对猪血管内皮细胞的杀伤作用。方法：利用核转染技术将质粒pcDNA3-sHLA-G1转入LCL721.221细胞株，并提取sHLA-G1。以RT-PCR、斑点酶联免疫吸附（Dot-ELISA）技术分别在基因水平和蛋白水平检测sHLA-G1的表达；以人类NK细胞系（NK92）为效应细胞，猪内皮细胞系PED为靶细胞，用β-己糖氨酶释放实验检测sHLA-G1抑制NK92释放穿孔素、颗粒酶；单四唑（MTT）法检测sHLA-G1抑制NK细胞的杀伤活性。结果：与未加入sHLA-G1的对照组相比，NK92释放的β-己糖氨酶显著减少（P〈0．05），且对sHLA-G1组PED的杀伤效率均有明显降低（P〈0．01）。结论：sHLA-G1可通过抑制NK92释放穿孔素、颗粒酶以减轻NK92对PED的杀伤作用。     

NK、T混合淋巴细胞与顺铂联合对乳腺癌MDA-MB-231细胞株体外杀伤研究

目的：探讨利用荧光染料CFSE标记法及MTT法,观察人NK、T混合淋巴细胞（NKTm）体外杀伤MDA-MB-231肿瘤株的效果。方法：应用CFSE/PI染色法及MTT法标记人乳腺癌MDA-MB-231肿瘤株,观察NKT细胞联合顺铂在各种时序下对乳腺癌MDA-MB-231肿瘤株的杀伤效果。结果：CFSE染色条件下,人NKTm细胞体外对MDA-MB-231细胞效靶比E/T=25：1时较E/T=12.5：1时杀伤率明显升高;E/T=12.5：1时杀伤率略低于顺铂;先加入NKTm各组随与顺铂间隔时间的延长而杀伤率升高（以上P均〈0.05）。结论：NKTm细胞对MDA-MB-231肿瘤细胞的直接杀伤作用强,同顺铂联用时要提高对肿瘤细胞的杀伤率应先给予NKTm细胞后应用顺铂。     

自然杀伤细胞联合他莫昔芬对乳腺癌细胞的杀伤作用及其机制

目的：通过体外实验观察自然杀伤细胞（NK细胞）联合他莫昔芬（TAM）对乳腺癌细胞（BCC）的协同杀伤作用,初步探讨其作用机制。方法：选用3种受体表达程度不同的BCC,设置空白对照组及TAM各浓度/时间梯度实验组,MTT法检测各组细胞增殖抑制率,并确定最终实验浓度为5 μmol·L^-1。设自然释放组、最大释放组、TAM组、NK细胞组和联合实验组（BCC+NK细胞+TAM）,钙黄绿素-AM释放法观察不同效靶比下两者的联合杀伤作用。设空白对照组（NK细胞）、NK细胞+TAM组、NK细胞+BCC组和联合实验组,ELISA法检测各组NK细胞中TNF-α和IFN-γ水平。设空白对照组（NK细胞）、NK细胞+TAM组、NK细胞+BCC组和联合实验组,流式分析法分别检测NK活化性受体（NKp46）、NK抑制性受体（CD158a、CD158b、CD158b2和CD158e）表达水平。设空白对照组（BCC）、BCC+TAM组、BCC+NK细胞组和联合实验组,流式细胞术检测各组细胞中活化性配体（MICA、ULBP1和ULBP2）的表达水平。结果：MTT法检测,TAM对3种BCC的增殖抑制率具有明显的时间和浓度依赖性（P<0.05）。钙黄绿素-AM释放法检测,随着效靶比的增加,与NK细胞组比较TAM组BCC杀伤率明显升高（P<0.01）,且联合组杀伤率明显高于NK细胞组和TAM组（P<0.05）。ELISA法检测,与空白对照组比较,各实验组无论有无BCC存在,NK细胞中分泌TFN-α和IFN-γ水平均升高（P<0.05或P<0.01）,且与TAM联合后TFN-α和IFN-γ水平明显升高（P<0.05）。流式细胞术检测,与空白对照组比较,各实验组NK细胞中NKp46表达水平均升高（P<0.05）;各实验组NK细胞中CD158a、CD158b、CD158b2和CD158e表达水平均明显下降（P<0.05）;各实验组BCC中MICA、ULBP1和ULBP2表达水平均明显升高（P<0.05）。结论：NK细胞与TAM联合体外杀伤BCC具有协同作用,其协同作用机制可能为TAM能够通过促进NK细胞分泌 TNF-α和IFN-γ而增强其杀伤能力;通过增加NK细胞活化性受体和活化性配体表达水平、降低NK细胞抑制性受体表达水平,进而增加NK细胞的杀伤能力。     

芍药醇对叔丁基过氧化氢损伤的血管内皮细胞的保护作用

目的：探讨芍药醇（PAE）对叔丁基过氧化氢（TBHP）损伤的血管内皮细胞的保护作用及其机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分为对照组（Control组）、造模组（TBHP组）和PAE处理组（各浓度PAE+THBP组）;用CCK8法及乳酸脱氢酶（LDH）检测各组HUVECs细胞增殖抑制情况,Transwell实验检测细胞的迁移能力,流式细胞仪和Cleaved-caspase 3免疫荧光染色检测HUVECs细胞凋亡情况。结果：与Control组比较,TBHP组细胞存活率和细胞迁移数明显降低,细胞凋亡率、LDH释放量和Cleaved-caspase 3蛋白的表达明显升高（均P＜0.05）。与TBHP组比较,PAE处理组细胞的存活率和细胞迁移数均随着给药浓度的增加而逐渐升高,细胞凋亡率、LDH释放量和Cleaved-caspase 3蛋白的表达均随着给药浓度的增加而逐渐下降（均P＜0.05）。结论：PAE通过抑制TBHP诱导的HUVECs细胞存活率降低、LDH释放量升高、细胞凋亡增多、Cleaved-caspase 3蛋白表达的上调,发挥其对TBHP损伤的血管内皮细胞的保护作用,且呈剂量依赖性。     

人鼻咽癌细胞株CNE2对NK细胞KIR/NKG2D受体的免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤功能的影响

目的 探讨NK细胞与表达NKG2D配体的人鼻咽癌细胞株CNE2混合培养后4、24、48h时KIR、NKG2D的变化及其对NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响.方法 PCR-SSP法检测CNE2细胞HLA-A、B、Cw表型、NK细胞KIR表型(选择3例健康者为试验对象),流式细胞仪检测对照组(新鲜分离的NK细胞)KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况.IL2组(IL2培养的NK细胞)、CNE2组(CNE2、IL2、NK细胞混合培养)培养后4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况,LDH释放法测定IL2组及CNE2组培养24 h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性.结果 CNE2细胞表面HLA-A、B、Cw表型为A2,24;B18,35;Cw4,7.3例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1.CNE2组4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3表达较对照组、IL2组明显升高(P＜0.01),NKG2D表达较对照组、IL2组明显降低(P＜0.01),KIR3DL1表达与对照组、IL2组相比无明显变化(P＞0.05).IL2组4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1及NKG2D表达与对照组相比无明显变化(P＞0.05).IL2组、CNE2组培养24 h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10∶1时分别为(26.%±1.47)%和(2.74±1.64)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01);效靶比20∶1时分别为(35.74±3.59)%和(4.57±2.41)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 NK细胞与NKG2D配体阳性的肿瘤细胞持续性接触,下凋NK细胞表面NKG2D表达,上调NK细胞表面与HLAⅠ类分子相结合的KIR表达,导致NK细胞对靶细胞杀伤活性减低.本研究阐明了编辑后的NK细胞杀伤活性减低的分子基础,同时提示阻断HLAⅠ类分子与KIR的结合或者增强NK细胞表面NKG2D的表达将有利于提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性.     

肝再生增强因子调控线粒体功能稳态在棕榈酸诱导肝细胞脂毒性细胞模型中的作用

目的：研究肝细胞脂毒性细胞模型中线粒体内肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）与线粒体功能障碍之间的关系。方法：以无脂肪酸的10%牛血清蛋白（bull serum albumin,BSA）处理L?O2细胞为对照（BSA组）,0.2 mmol/L棕榈酸（palmitic acid,PA）处理L?O2细胞为脂毒性细胞模型（PA组）,并在构建ALR过表达（ALR?OE组）及对照（Vector组）细胞后,分别接受BSA和PA处理,CCK?8法检测细胞活力、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）检测试剂盒检测脂毒性、JC?1染色分析线粒体膜电位、流式凋亡检测分析细胞凋亡,Western bolt检测ALR、Bax、Bcl?2、细胞色素C等蛋白表达水平。结果：与BSA组相比,PA组细胞内脂滴增多、细胞活力下降50%、LDH释放增加13倍,线粒体内ALR表达则明显降低。BSA处理下Vector组和ALR?OE组无明显差异,而PA刺激后ALR?OE组相较于Vector组,细胞活力增加约16%,LDH释放减少约40%,线粒体膜电位增加约18%,细胞色素C释放减少,细胞凋亡减少。结论：ALR参与肝细胞脂毒性的发生,靶向调控ALR可在一定程度上抑制脂毒性的发生。     

同种异体 NK 细胞对 CD34+CD38-早期急性髓系白血病细胞的体外杀伤作用

目的：探讨同种异体NK细胞对CD34＋CD38－早期急性髓系白血病细胞（ KG1a细胞）的体外杀伤作用。方法免疫磁珠法分离5例健康志愿者外周血的NK细胞,分别用乳酸脱氢酶杀伤实验（ LDH法）、流式仪检测细胞凋亡及甲基纤维素克隆形成实验观察NK细胞在不同效靶比（1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1）浓度对KG1a细胞的体外杀伤作用,取单纯培养的KG1a细胞作阴性对照。结果急性髓系白血病细胞株KG1a中CD34＋CD38－细胞比例为（97.2±3.1）％,分选后的NK细胞CD3－CD16＋CD56＋细胞纯度为（93.5±3.2）％。5个效靶比NK细胞对KG1a细胞均有杀伤作用,且均能抑制其克隆形成,随着靶效比的升高,其杀伤活性及克隆抑制率也随着升高（P＜0.05）。 NK细胞与KG1a共培养后的细胞凋亡率均比阴性对照高（P＜0.05）,但到20∶1的靶效比浓度后并不随着浓度的升高而升高（P＞0.05）。而随着效靶比增加,NK细胞对KG1a细胞的克隆抑制作用也越强,各效靶比浓度间的差异均有统计学意义（ P＜0.05）。结论通过抑制CD34＋CD38－早期急性髓系白血病细胞的增殖和诱导细胞凋亡,同种异体NK细胞能有效杀伤CD34＋CD38－早期急性髓系白血病细胞。