新型禽源人流感病毒(H7N9)的小鼠感染模型和传播模型建立

目的建立新型禽源人流感病毒(H7N9)小鼠模型和可能的H7N9致病性和传播力研究。方法 H7N9病毒感染小鼠,并与同居小鼠合笼,研究同居小鼠的临床指征变化,病毒复制情况,病毒在组织中的分布,以及病理变化。通过观察同居小鼠的发病情况等方面研究H7N9病毒在同笼小鼠中的传播能力。结果研究表明H7N9病毒能有效地感染小鼠并造成致死,可以通过直接接触传播感染小鼠并引起病理等改变。结论建立了H7N9小鼠模型,并对小鼠通过接触传播感染进行了初步研究,为深入研究传播力奠定了基础。     

新型H7N9病毒在同居小鼠中的传播途径

目的 进一步了解新型H7N9流感病毒的致病性、传播能力以及通过何种途径进行传播。方法 H7N9病毒感染小鼠后与同居小鼠合笼，研究同居小鼠的临床变化指征、病毒复制情况、病毒在组织中的分布以及病理变化。以同居小鼠分泌物接种其他小鼠，观察同居小鼠通过何种途径传播病毒。结果 H7N9病毒可以在肺组织、肠组织和脑组织中复制，并可以在同居小鼠中传播。H7N9病毒感染小鼠其咽、眼分泌物以及粪便均具有感染性，其中尤以咽拭子的传播风险最高。结论 H7N9病毒可以不通过适应就感染小鼠，并引起小鼠间传播。被感染小鼠分泌物具有感染性。     

应用季节性流感病毒H3N2鼠适应株建立小鼠模型

目的应用季节性流感病毒H3N2鼠适应株建立小鼠模型,并阐述适应株致病力变化的分子机制。方法 A/Aichi/2/68(H3N2)(WT)在小鼠体内多次适应获得鼠适应株(MA-7),MA-7经鼻感染BALB/c小鼠,根据临床症状、体重下降率、病毒复制和组织病理等关键指标判断小鼠模型构建成立,分析适应株致病力变化的分子机制。结果小鼠感染WT后无明显症状且未检测到病毒复制。MA-7感染后小鼠9 d内全部死亡,体重下降率超过30%,多组织内均能检测到病毒复制,肺组织中滴度高达105. 5TCID50并出现间质性肺炎。基因比对发现MA-7在HA、NA、PA和NP基因上有5个位点发生突变。结论成功建立了H3N2适应株小鼠模型,可用于研究H3N2流感病毒发病机制及其药物、疫苗、抗体评价等,其适应株致病力增强可能与5个突变位点有关。     

H7N9禽流感病毒与其他流感病毒对雪貂致病性与传播力的比较

目的 针对2013年3月中国爆发的人感染H7N9禽流感病毒,在雪貂体内进行致病性及传播力的研究,并与甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒进行比较。方法 对新发H7N9毒株、甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒感染雪貂后的临床症状、体征,呼吸道排毒情况,组织病理学变化等进行评价和比较,并对H7N9毒株在雪貂群体中的传播力进行研究。结果 雪貂模型的临床症状、死亡率、病毒传播以及组织病理学分析显示：H7N9病毒的致病性低于H5N1,与2009年起源于北美的甲型H1N1流感病毒相当。新发H7N9禽流感病毒可以在雪貂的呼吸道、心脏、肝脏以及嗅球进行复制。值得注意的是H7N9禽流感可以通过飞沫在雪貂间进行低水平的传播,并且在传播过程中,病毒基因组内有多个位点的氨基酸发生了替换。结论 H7N9禽流感病毒对雪貂的致病性较H5N1禽流感病毒低,与甲型H1N1流感病毒对雪貂的致病性相当,H7N9禽流感病毒可在雪貂间进行传播。     

生理性衰老小鼠的感染免疫模型建立

目的生理性衰老导致机体免疫功能下调,进而使老年人群感染免疫应答能力降低,针对新发突发传染病的病原体如重症流感病毒的易感性上升,罹患感染后,临床症状也更严重,预后不佳。因此,本课题组建立一个拟合临床重症流感病毒感染的老年小鼠模型,用于评价老年宿主感染免疫应答特征。方法采用不同毒力的流感病毒H7N9(高致病性)、H9N2(低致病性)分别滴鼻感染老年C57小鼠(18～24月龄),分析其感染后体重变化和生存情况,并动态检测肺内病毒的复制,炎症因子的表达以及肺的病理损伤。结果与成年对照组小鼠(6～8周龄)相比,老年小鼠感染H9N2后7天体重下降了30%(成年对照仅下降10%),生存率降低至50%(成年对照为100%)。老年小鼠肺内H9N2病毒复制更高(P0.01),感染后第2天达到峰值(每克肺内RNA病毒拷贝为3.2×10~4);以炎症因子IL-6、趋化因子MCP-1为代表的肺内炎症过量表达,是成年对照的100～1000倍;肺病理染色提示老年小鼠肺损伤更严重,感染后修复时间更长。结论成功建立老年小鼠感染模型,在感染生存、肺病毒复制和炎症损伤等方面可以重现临床感染免疫应答的现象。可应用于深入理解老年宿主感染相关的机制研究与抗感染药物评价。     

集束化护理在人感染H7N9禽流感防治呼吸机相关性肺炎的应用

人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。甲型流感的H7病毒是一组通常在鸟类中传播的流感病毒。H7N9型禽流感是一种新型禽流感病毒,并且可导致人类感染,于2013年3月31日在中国上海和安徽两地率先报告,在国内流行趋势为散发。H7N9病毒感染后可在早期出现发热等症状。传播途径为经呼吸道传播,直接接触病毒也可被感染。高危人群主为从事禽类养殖、销售、宰杀、加工者,     

H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性

目的进一步探讨H7N9禽流感病毒对哺乳动物的感染与致病能力,并对其分子机制进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过病毒全基因组测序及比对探寻适应的分子机制。结果禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒,经过在小鼠体内进行9次传代后,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因,NA基因以及PA亚基共发生了4个有义突变。结论禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒经连续传代后基因发生突变,但对病毒的毒力以及致病力影响仍需后续实验验证。     

H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性研究

目的进一步探讨H7N9禽流感病毒对哺乳动物的感染与致病能力,并对其分子机制进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,在BALB／c小鼠肺组织中连续传代,通过病毒全基因组测序及比对探寻适应的分子机制。结果禽流感H7N9A／Anhui／1／2013病毒,经过在小鼠体内进行9次传代后,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因,NA基因以及PA亚基共发生了4个有义突变。结论禽流感H7N9A／Anhui／1／2013病毒经连续传代后基因发生突变,但对病毒的毒力以及致病力影响仍需后续实验验证。     

H7N9禽流感病毒小鼠感染动物模型的建立

目的 建立H7N9小鼠感染动物模型。方法 1?08,1?07或1?06 TCID50H7N9禽流感病毒原液（A/Anhui/1/2013）滴鼻感染BALB/c小鼠。主要观测指标：临床症状、死亡率、病理变化、病毒载量和血清抗体检测。结果 被感染的小鼠表现为竖毛、弓背、体重下降;病理表现为间质性肺炎,感染后第2天开始在呼吸道脱落细胞中检测到病毒;免疫组化或病毒分离方法在肺、肾、脑、肠、脾等组织检测到病毒;感染后14d在小鼠血清中血凝抑制试验特异性抗体效价达到160;淋巴细胞减少,单核细胞增多。结论 H7N9感染BALB/c小鼠模型与人类禽流感感染疾病的基本特征相似,为研究该病的发病机制及药物疫苗的研发提供了工作基础。     

人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析

目的 对比分析人高致病H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒及H1N1流感病毒分别感染BALB/c小鼠后的机体反应特征。方法 分别以H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠存活率、体征变化及感染后肺组织病理损伤差异,检测小鼠感染流感病毒后肺组织增殖细胞核抗原（PCNA）表达并观察小鼠感染后修复状况。结果 H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒均感染BALB/c小鼠,小鼠存活率依次为H7N9>H1N1>H5N1,肺组织病理损伤严重程度依次为H5N1 >H1N1 >H7N9,PCNA表达水平依次为H7N9 >H1N1 >H5N1。结论 H7N9病毒感染后宿主炎症反应较小,感染后小鼠肺组织自我修复能力较强;H5N1病毒感染BALB/c小鼠后的机体反应最为强烈,感染后恢复能力差,致死率高。     

人H7N9禽流感病毒与H1N1流感病毒感染小鼠病理学损伤的比较

目的 比较分析H7N9病毒与H1N1病毒感染小鼠病理学损伤特点,初步探讨两种病毒感染致小鼠急性肺损伤的致病机制. 方法 H7N9病毒与H1N1病毒分别感染小鼠,观察不同病毒感染后小鼠生存率,并于不同时间点取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织,伊红-苏木素染色并进行组织病理学分析,免疫组化检测病毒抗原分布及中性粒细胞浸润.综合分析肺组织病理损伤与病毒复制、宿主免疫反应之间的关系. 结果 H7N9病毒感染小鼠肺及脾脏损伤较轻,存活率较高.H1N1 病毒感染的小鼠肺及脾脏损伤较重,感染后9 d全部死亡;两种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、少量间质细胞和肺泡上皮细胞,病毒复制水平无明显差异.但H1N1病毒感染后肺及脾脏中均有大量中性粒细胞浸润,小鼠机体炎症反应明显强于H7N9病毒感染后小鼠炎症反应. 结论 H7N9病毒与H1N1病毒感染后小鼠病理学损伤特点及程度均不同,病毒复制是小鼠肺损伤的诱发因素但并非决定因素,宿主针对病毒感染产生的免疫反应程度与急性肺损伤密切相关.     

Acute lung injury induced by H9N2 virus in mice

Background H9N2 avian influenza viruses （AIVs） have repeatedly caused infections in mammals even humans in many countries. The purpose of our study was to evaluate the acute lung injury （ALl） caused by H9N2 viral infection in mice. Methods Six- to eight- week-old female SPF C57BL/6 mice were infected intranasally with lx104 MIDso of A/HONG KONG/2108/2003 [H9N2 （HK）] virus. Clinical signs, pathological changes, virus titration in tissues of mice, arterial blood gas, and cytokines in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and serum were observed at different time points after AIV infection. Results H9N2-AIV-infected mice exhibited severe respiratory syndrome, with a mortality rate of 50%. Lung histopathological changes in infected mice included diffuse pneumonia, alveolar damage, inflammatory cellular infiltration, interstitial and alveolar edema, and hemorrhage. In addition, HgN2 viral infection resulted in severe progressive hypoxemia, lymphopenia, and a significant increase in interleukin 1, interleukin 6, tumor necrosis factor, and interferon in BALF and serum. Conclusions The results suggest that H9N2 viral infection induces a typical ALl in mice that resembles the common features of ALl. Our data may facilitate the future studies of potential avian H9N2 disease in humans.     

H1N1流感与H7N9禽流感感染BALB/c小鼠发病特点初步研究

目的本实验旨在初步探讨A／shanghai／4664T（H7N9）和A／PuertoRico／8／34（H1N1）病毒感染BALB／c小鼠的发病特点,为H7N9致病机制与防治的研究提供数据支持。方法将同等剂量（5×10^3TCID50）流感病毒滴鼻感染BALB／c小鼠,分析其在感染后体重、肺指数、病毒载量和肺组织病理的变化情况。结果H1N1PR8感染组和H7N9感染组小鼠在7d内体重均持续减低,H1N1PR8组较H7N9组降低更为明显;在感染后3dH7N9组与PBS组肺指数无显著差异（P〉0．05）,但感染后7dH7N9组与PBS组相比显著增高（P〈0．05）;H1NlPR8组比H7N9组感染后3d肺指数显著增高（P〈0．05）,但感染后第7天无显著差异（P〉0．05）。H1N1PR8组和H7N9组病毒载量在感染后第3天均显著升高,但两组无显著差异;第7天两组病毒载量均有所降低,但H7N9组病毒载量显著高于H1N1PR8组（P〈0．05）。H1N1PR8在感染后3d主要病理变化为炎症细胞浸润和水肿,而H7N9组主要轻度炎症细胞浸润;在感染后7dH1N1PR8组可见大量炎症细胞浸润,出现大面积肺水肿;H7N9组表现为大量炎症细胞浸润。结论H7N9和H1N1PR8感染BALB／c小鼠均可发病,但发病特点有所差异,H7N9病毒对鼠的适应性比H1N1PR8差。     

BALB/c小鼠和雪貂感染H7N9禽流感病毒后的肺组织动态病理学变化

目的 了解用H7N9禽流感病毒分别感染BALB/c小鼠和雪貂后,其肺部动态病理改变,为临床诊断、治疗、预防及机制研究提供帮助。方法 BALB/c小鼠经鼻腔接种10⁶EID₅₀（50 μL）H7N9禽流感病毒后第1、2、3、5、7、14、28天分别安乐死2～3只小鼠;雪貂经鼻腔吸入接种10⁶EID₅₀（500 μL）H7N9禽流感病毒后第3、7、14、28天分别安乐死1只雪貂,分别观察动物的临床特征改变,肺组织的大体组织形态学变化,HE染色观察动态病理改变,免疫组化染色观察病毒分布及肺组织各种炎细胞的浸润情况。结果 感染病毒后的小鼠出现竖毛、嗜睡、死亡等表现,雪貂表现为打喷嚏、鼻腔分泌物、稀便、嗜睡等;大体观察小鼠与雪貂肺组织均可见到暗红色病灶;光镜观察小鼠与雪貂的肺组织均呈现坏死性支气管炎和渗出性间质性肺炎、肺泡炎。感染第2天开始出现炎性病变,7～9 d炎症病变最严重,14 d后逐渐修复吸收,28 d基本完全吸收;T、B淋巴细胞,巨噬细胞不同程度的表达增多,以T细胞增多为主,尤其是CD8⁺ T细胞两种动物均大量表达。结论 H7N9禽流感病毒感染可引起BALB/c小鼠和雪貂肺组织急性支气管炎和肺炎,感染后7～9 d肺部炎症的组织病理学变化最严重,CD8⁺T细胞明显增多,14 d后病灶逐渐吸收。该研究可为临床诊断、治疗、预防该病及进行疾病机制研究提供帮助。     

季节性流感疫苗对小鼠感染H7N9禽流感病毒的保护效力

目的 评价季节性流感裂解疫苗对流感病毒H7N9的免疫保护效力。方法 用我国2012～2013年度季节性流感裂解疫苗,以腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠,并设PBS免疫模型组,末次免疫14 d后以5 LD₅₀ A/Anhui/1（H7N9）进行攻试验。感染后观察记录小鼠临床表现,体重变化,并分别于第2天和第4天每组处死3只小鼠,取肺组织和鼻甲骨测病毒滴度和载量。结果 感染后疫苗与模型组小鼠体重下降明显,疫苗组存活率为10%,模型组全部死亡。感染后第4天疫苗组鼻甲骨滴度显著低于模型组。血凝抑制试验及中和实验表明免疫小鼠血清无中和H7N9病毒抗体。结论 季节性流感疫苗在小鼠中对于H7N9流感病毒感染无明显保护作用。     

MAN2C1基因在病毒感染中的作用

目的通过观察MAN2C1转基因小鼠对H5N1高致病性禽流感病毒的易感性,以了解此转基因小鼠的免疫应答情况和MAN2C1基因在病毒感染中的作用。方法以H5N1高致病性禽流感病毒滴鼻感染MAN2C1转基因小鼠,HE染色观察小鼠肺组织病理变化;RT-PCR和免疫组织化学方法检测小鼠肺组织H5N1病毒载量;间接ELISA方法检测小鼠血清抗体滴度变化。结果与对照组小鼠比较,MAN2C1转基因小鼠表现为更为严重的间质性肺炎,肺组织病毒载量增加,外周血中性粒细胞数目降低,淋巴细胞数量增加,血清IgG抗体滴度降低。结论MAN2C1基因抑制了小鼠的体液免疫。     

禽流感H5N1亚型病毒对五个不同品系小鼠致病性的比较

目的 比较了不同遗传背景小鼠对禽流感H5N1亚型病毒的致病敏感性,为H5N1禽流感模型制作和机理研究提供依据.方法 近交系BALB/c、C57BL/6和封闭群ICR、NIH Swiss和KM Swiss共五个不同品系小鼠.每个品系实验动物30只,分接毒组20只,空白对照组10只,每组雌雄各半.病毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1),经测定TCID50为10-4.875/mL.接毒组通过鼻腔接种0.1 mL病毒液,对照组接种正常鸡胚尿囊液.小鼠接毒后连续观察14 d,观察记录临床症状、体温、体重变化,对在实验期间死亡和实验14 d结束后仍然存活的小鼠均进行组织器官病理取材,进行RT-PCR病毒分离检测、HE染色及H5N1抗原特异性免疫组化染色.结果 ①临床症状:H5N1禽流感病毒能感染五个品系的小鼠,引起呼吸急促等症状和一过性体重、体温下降.②死亡情况:小鼠在接毒后第1天即出现死亡,死亡的高峰期集中在接毒后第3～6天.五个品系小鼠死亡率存在差异,BALB/c为70%,ICR为50%,NIH Swiss为40%,C57BL/6为25%,KM Swiss为10%;③病毒分离:各组接毒小鼠在死亡后均进行了病毒分离,死亡小鼠的肺脏均分离到病毒,其他脏器未分离到病毒.④病理变化:实验期间五个品系死亡小鼠肺脏病理改变相近.大体观:死亡小鼠肺部淤血,呈暗红色,体积增大,局部肺组织实变.镜下观:死亡小鼠的共同病理改变为间质性肺炎,具体表现为肺泡腔及间质出血、炎性细胞浸润;间质增生,肺泡隔增宽;肺泡腔中见纤维素性渗出,透明膜形成.⑤免疫组化结果:在死亡小鼠的气管上皮细胞和肺巨噬细胞可观察到H5N1禽流感病毒阳性表达.结论 小鼠作为H5N1禽流感病毒模型具有普适性,不同品系小鼠感染鹅源H5N1禽流感病毒的临床症状、病程和病理变化与人禽流感病例相似.不同品系小鼠的死亡比例有明显差别,可以根据不同的实验目的,选择不同品系的小鼠制作H5N1禽流感动物模型.不同品系的遗传特性对禽流感易感性产生明显的影响,遗传背景可能与H5N1禽流感病毒感染应答机理存在联系:BALB/c和C57BL/6均为近交系,其中BALB/c小鼠的品系特征之一表现为干扰素产量低,接种H5N1病毒后表现为高死亡率(70%),而C57BL/6小鼠的干扰素产量高,接种H5N1病毒后表现为低死亡率(25%),提示不同遗传背景小鼠的干扰素水平与H5N1感染致死具相关性.为进一步研究H5N1禽流感病毒易感性相关基因以及其与宿主免疫反应的关系提供了一个研究基础.