鼠巨噬细胞培养弓形虫RH株速殖子的实验研究

目的用鼠巨噬细胞培养弓形虫RH株速殖子及观察弓形虫速殖子入侵鼠巨噬细胞及在其内繁殖的过程.方法按培养传代细胞的常规方法培养鼠巨噬细胞,将鼠巨噬细胞接种到盖玻片上,用弓形虫RH株速殖子感染巨噬细胞,每隔1.5小时取出盖玻片,经吉氏染色、二甲苯透明后,镜下观察摄片.结果弓形虫速殖子大多在感染后0.5 ～1小时侵入巨噬细胞,10小时后,假包囊形成,20小时后,假包囊破裂,在室温条件下,速殖子可在巨噬细胞中存活20天.结论鼠巨噬细胞可代替小鼠用于弓形虫病的诊断及保种.     

尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的影响

目的：观察刚地弓形虫速殖子在来源于安徽省南部地区的尖吻蝮蛇蛇毒的作用下侵入Hela细胞的数量，探讨尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的作用。方法：以不同浓度尖吻蝮蛇毒加入分孔培养的细胞中，于不同时间观察感染弓形虫速殖子细胞的数量。结果：尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞有明显的促进作用，弓形虫速殖子在蛇毒的作用下在同一时间内对宿主细胞侵入的数量均高于对照组(P＜0．05——P＜0．01)，但不同剂量的尖吻蝮蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的作用差异无显著性(P＞0．05)。5．0μg/ml和0．25μg/ml的剂量分别比对照组平均提高了125．49％和81．37％。结论：尖吻蝮蛇毒可以明显增加弓形虫速殖子对宿主细胞的感染率。     

复方一枝蒿颗粒体外抗弓形虫RH株速殖子的超微结构观察

目的 探索复方一枝蒿颗粒体外对弓形虫RH株速殖子超微结构的影响。方法 收集弓形虫RH株速殖子感染72 h后的昆明（KM）小鼠腹腔冲洗液,加入复方一枝蒿颗粒水溶液使药物终浓度达到0.8 mg/mL,并以0.04 mg/mL剂量阿奇霉素作为阳性药物对照,同时设立空白对照组。置二氧化碳孵箱作用2 h,分别制备吉瑞氏复合染色涂片和透射电镜样本,比较观察各实验组弓形虫速殖子光镜下形态和透射电镜下超微结构。结果 空白对照组虫体符合弓形虫速殖子超微结构正常形态,而阳性药物对照组和复方一枝蒿颗粒作用组均显示着色较浅的异常形态虫体：虫体肿胀变形,两端钝圆。细胞质着色浅且偶见空泡,个别虫体细胞膜似有断裂缺如,胞膜不完整。透射电镜下可见阳性药物对照组和复方一枝蒿组弓形虫速殖子细胞质疏松并出现大量不规则空泡等异常形态,复方一枝蒿颗粒还可使弓形虫速殖子超微结构发生胞膜断裂、破损,核膜破损,致密颗粒增多等改变。结论 复方一枝蒿颗粒具有损伤弓形虫速殖子超微结构的直接作用。     

弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系的建立

目的 建立弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系.方法 纯化弓形虫RH株速殖子,按一定比例和条件接种于COS-7细胞内进行体外培养.分别在接种后第1、2、3、4、5、6天观察细胞和虫体的形态并提取Total RNA,用RT-PCR的方法检测速殖子期特异性蛋白SAG1基因、缓殖子期特异性蛋白BAG1基因和SAG2C基因的表达.结果 随着速殖子在COS-7细胞中培养时间的延续,虫体的数量逐渐增多,但增殖速度逐步减缓;虫体在细胞内的排列方式也在不断变化,由成对的弧形、玫瑰花形或簇形、变成半圆形最后形成圆形的类包囊样结构.RT-PCR检测显示:速殖子期特异性蛋白SAG1基因在培养的第1～6天均有表达,且表达量呈递增趋势;缓殖子期特异性蛋白BAG1基因从第2天开始出现表达,随时间延续表达量逐渐增加;缓殖子期特异性蛋白SAG2C基因从第5天开始表达,第6天表达量增加.以上结果表明有越来越多的速殖子转化为缓殖子.改变培养条件,缓殖子也能向速殖子转化.结论 成功构建弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转化体系,为其转化机制的研究奠定了基础.     

常用消毒剂及自来水对弓形虫速殖子活力的影响

目的了解常用消毒剂及自来水对弓形虫速殖子活力的影响。方法将各种消毒剂分别加入等体积含弓形虫速殖子的小鼠腹水中，在不同时间内观察虫体胎盘蓝（trypanblue）着色率及活动率，并将经消毒剂处理不同时间的速殖予接种昆明鼠，观察速殖子能否在接种鼠体内复苏繁殖，导致小鼠死亡。用类似方法观察自来水时速殖子的影响。结果除甲醛个速殖子在常用浓度的不同消毒剂中，lmin月台盘蓝着色率均为100％，活动率为0。经消毒剂处理1min的速殖子接种小鼠后，各组接种鼠（包括甲醛处理组）无一死亡。经自来水处理4h的速殖子接种小鼠后仍能在小鼠体内复苏繁殖，小鼠于接种1wk内全部死亡。结论弓形虫速殖子对常用消毒剂均很敏感；而在自来水中途殖子可保持感染力4h以上。     

刚地弓形虫RH株速殖子外泌体的分离与鉴定

目的: 分离与鉴定刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株速殖子外泌体。方法: 收集弓形虫速殖子与人结肠癌SW480细胞共培养上清液,经离心、过滤,采用基于聚合物沉淀技术的试剂盒法分离外泌体;透射电镜观察外泌体形态特征,纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体粒径大小,蛋白质印迹法检测外泌体经典标志分子CD63、HSP70以及弓形虫特异蛋白表面抗原1（surface antigen 1,SAG1）、棒状体蛋白16（rhoptry protein 16,ROP16）、ROP18和致密颗粒蛋白1（dense granule protein 1,GRA1）。结果： 从弓形虫与细胞共培养上清液中分离出囊泡样物质,其外形为圆形,有完整的膜结构,直径为30~150 nm;表达外泌体特异性蛋白CD63、HSP70;检测出弓形虫特异性蛋白SAG1、ROP16、ROP18和GRA1。结论： 从弓形虫速殖子与SW480细胞共培养上清液中获得弓形虫外泌体。     

红霉素、阿奇霉素、磺胺嘧啶、大蒜素体外抗弓形虫作用的研究

目的　比较阿奇霉素、红霉素、磺胺嘧啶、大蒜素体外抗弓形虫的效果。方法　用弓形虫RH株速殖子感染培养的巨噬细胞 ,每一种药物根据预实验设立 2至 3个浓度 ,分别在速殖子侵入细胞前和侵入细胞后用不同浓度的药物处理 ,每隔 1h在倒置显微镜下观察细胞及弓形虫的形态及生长情况 ,9d后取出盖玻片 ,染色透明后 ,镜下观察。再将培养液及培养细胞注入鼠腹腔 ,观察小鼠的发病情况。结果　阿奇霉素的浓度在 2 0 μg/ml时具有抑制虫体生长的作用 ,>40 μg/ml时对巨噬细胞有明显的毒性。红霉素的浓度在 10 0 μg/ml、15 0 μg/ml时可抑制弓形虫的生长与繁殖 ,但不能完全杀死虫体 ,形成假包囊。将假包囊及培养液接种小鼠腹腔 6d后小鼠发病死亡 ,解剖小鼠后 ,可见大量的虫体。没有观察到 10 0 μg/ml、2 0 0 μg/ml的磺胺嘧啶及 2 0 μg/ml、40 μg/ml的大蒜素有抑制弓形虫生长的作用。 结论　阿奇霉素具有明显杀灭速殖子的作用。低浓度的红霉素有利于包囊形成。磺胺嘧啶、大蒜素体外无杀灭速殖子的作用。     

环孢素对弓形虫的作用及其感染新生地鼠肾细胞的体外研究

器官移植术后使用免疫抑制剂导致免疫功能紊乱是弓形虫发病的重要原因。环孢素 (ＣｓＡ)是一种重要的免疫抑制剂 ,研究发现环孢素具有抗寄生虫作用 ,如疟疾、血吸虫及鞭虫等[1] 。为研究环孢素在体外对弓形虫的作用及药物浓度与入侵细胞的关系 ,我们观察了ＣｓＡ对弓形虫在细胞内和细胞外的作用 ,及其对弓形虫入侵体外培养新生地鼠肾 (ＢＨＫ)细胞的影响。一、材料和方法1.弓形虫速殖子来源和纯化法 :将冻存于液氮中的虫体(速殖子 ,ＲＨ株 )取出复苏后 ,传代接种于健康小白鼠腹腔至毒力恢复。虫体繁殖高峰时取腹腔液 ,磷酸盐缓冲液 (ＰＢＳ)…     

弓形虫速殖子死活快速鉴别的实验研究

目的寻求快速鉴别弓形虫速殖子死活的染色方法。方法用0．1％伊文思蓝、0．4％台盼蓝和0．5％溴酚蓝三种染液分别对死、活弓形虫速殖子进行染色。结果前二种染液均能使死亡弓形虫速殖子在1min内着色,活虫则不着色;后一种染液能使活动弓形虫速殖子在1min内着色,死虫则不着色。结论3种染液染色均可快速鉴别弓形虫速殖子死活。     

弓形虫速殖子在宿主细胞内增殖与丝裂原激活蛋白激酶表达

目的:观察RH株弓形虫速殖子在不同培养基中及在NIH3T3和MRC5细胞内的增殖,比较其丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)表达的差异.方法:速殖子细胞培养观察宿主细胞的感染率,不同培养时间观察培养基中游离速殖子数量,Western blot分析在不同条件下MAPK的表达.结果:在MEM培养基中RH株速殖子的增殖速度明显高于在DMEM培养基中的增殖速度;其感染细胞百分率和培养基中游离速殖子计数均有显著差别;Western blot分析表明在二者具有MAPK识别的差异.结论:MEM和DMEM两种培养基对RH株速殖子的增殖有显著影响,初步结果表明其差异与MAPK有关.     

激光照射对弓形虫活力及免疫原性的作用

目的 观察激光照射对弓形虫活力及免疫原性的影响.方法 分别用经2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0 W/cm2光通量1 min激光照射的RH株弓形虫速殖子常规腹腔内感染BALB/c小鼠,观察存活小鼠体内弓形虫包囊的形成和抗体效价、弓形虫速殖子的活力及繁殖力.结果 4.5-6.0 W/cm2光通量激光照射后的虫体接种小鼠,小鼠全部存活,并能诱导IgG抗体的产生.此外,该光通量激光照射能使弓形虫的分裂繁殖及包囊形成抑制,活力明显减弱,死亡虫数增加.结论 激光照射能有效抑制弓形虫繁殖和分裂能力,照射后的虫体能有效诱导小鼠体液免疫应答.     

大蒜素对弓形虫感染小鼠黏膜免疫应答的影响

目的通过测定弓形虫感染小鼠大蒜素治疗后黏膜部位SIgA含量,研究大蒜素在弓形虫感染免疫中所起作用。方法将雌性小鼠分成治疗组、感染组和对照组,用5×10~4个/只RH株弓形虫速殖子经口感染小鼠后大蒜素治疗,每天1次,于治疗后第0、2、4、6、8、10、12周断颈处死,冲洗上呼吸道、下呼吸道、肠道、阴道、子宫黏膜,夹心ELISA法测定SIgA抗体含量。结果在观察的时间段内,治疗组SIgA含量高于对照组和感染组,治疗后4、6、8周差异具有显著性(P0.05)。结论大蒜素治疗经口感染弓形虫速殖子小鼠,能提高黏膜(特别是消化道黏膜)SIgA抗体含量,保护机体抵御病原体感染。     

调控宿主细胞自噬对弓形虫在宿主细胞内增殖的影响

目的：研究细胞自噬在弓形虫增殖复制中的作用。方法分别用自噬抑制剂Bafilomycin A1及自噬诱导剂氯化锂作用于人胚胎成纤维细胞( HEF),然后将弓形虫( RH株)速殖子悬液分别以虫/细胞2∶1、4∶1、8∶1、16∶1感染HEF细胞,作用1、2、4、8、24、48、96 h。采用吖啶橙( AO)荧光染色和丹酰尸胺( MDC)荧光染色检测HEF细胞自噬情况,采用Giemsa染色检测不同时间点的弓形虫感染复制动力学。结果 AO 和 MDC 荧光染色结果表明自噬抑制剂Bafilomycin A1及自噬诱导剂氯化锂可分别抑制和促进HEF细胞自噬,Giemsa染色结果显示使用自噬诱导剂氯化锂可以促进弓形虫在 HEF细胞内的增殖,使用自噬抑制剂 Ba-filomycin A1可以抑制弓形虫在HEF细胞内的增殖。结论调控宿主细胞自噬可调控弓形虫增殖复制。     

匹多莫德体外抑制弓形虫增殖作用的研究

目的评价匹多莫德对体外细胞培养弓形虫的抑制作用。方法在96孔板中采用Hela细胞培养稳定表达绿色荧光蛋白的弓形虫RH株速殖子,实验设匹多莫德用药组、磺胺甲嗯唑（SMX）用药组、SMX＋匹多莫德联合用药组以及未用药对照组,观察比较绿色荧光弓形虫速殖子给药后48、72、96h和120h的增殖情况及活虫数。结果与未用药组比较,SMX1mg／ml（P〈0．01）、0．5mg／ml（P〈0．01）和0．25mg／ml（P〈0．01）剂量组在各时间点均可显著抑制弓形虫速殖子的增殖;匹多莫德25μg／ml（P〈0．05）、12．5μg／ml（P〈0．05）和6．25μg／ml（P〈0．05）剂量组均可一定程度地抑制弓形虫速殖子的增殖;SMX（0．25mg／ml）＋匹多莫德（25μg／ml）活虫数最低,与SMX1mg／ml单独使用对弓形虫速殖子的抑制作用相近（P=0．311）。结论匹多莫德具有一定的体外抑制弓形虫速殖子增殖的作用;匹多莫德与SMX联合应用既能降低SMX用量又能有效抑虫。     

孕期弓形虫感染对胎盘的入侵和病理损害的研究

目的探讨孕期弓形虫感染对胎盘的入侵和病理损害情况。方法孕8dBALB/c小鼠经腹腔接种弓形虫速殖子,在孕10、12、14、16和18d剖腹取胎鼠,分离胎盘并精确称重。采用HE染色观察胎盘的病理损害情况,RNA原位杂交检测胎盘组织弓形虫速殖子的动态入侵。结果在孕10、12d,感染组胎盘重量与对照组比较无明显差别。而在孕14、16、18d,感染组的胎盘重量明显低于对照组(P0.01)。随着感染时间的延长,胎盘组织切片可见有大量淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞浸润,绒毛血管减少,显示有炎症表现;滋养层细胞破坏明显,可见凋亡小体形成。感染组小鼠在孕10d未检测到虫体,感染孕12d偶见虫体。孕14、16、18d虫体数目明显增多(P0.01),虫体主要位于滋养层细胞内、细胞间质和血管中,并有假包囊形成。结论孕期弓形虫感染可影响胎盘生长,胎盘出现炎症反应和凋亡等病理损害。虫体可侵入胎盘组织细胞间质和血管中,并侵入滋养层细胞内增殖,跨越胎盘屏障传播给胎儿。     

检测弓形虫的PCR法和ELISA法的比较

目的:建立快速、敏感、特异的PCR方法,用于检测弓形虫感染。方法:选择弓形虫B1基因194bp片段作为扩增模板,优化反应条件,并测定其敏感性和特异性;以104弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,用PCR法检测感染动物全血DNA,并与ELISA法检测血清IgM进行比较。结果:本实验中,PCR方法的检测阈值为0.2pg弓形虫DNA,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。用PCR法检测感染动物全血DNA,感染后第2d即可测出阳性,总阳性数为1(313/15);而ELISA法检测血清IgM则到感染后第6d才测出阳性,总阳性数为2(2/15)。经统计学检验,二者存在显著差异(P<0.05)。结论:PCR是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于弓形虫病的早期诊断。