Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的 探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法 利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式，通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果 原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处，即预定的背部。高表达ripply1后，在胚盾期背部标记基因表达范围扩大，腹部标记基因表达减弱，受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型：头部增大，腹部卵黄延伸减弱，尾部躯干及尾部区域减少，有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达，并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏环化的影响

目的 探讨基质金属蛋白酶21(matrix metallopeptidase 21,MMP21)基因表达下调对斑马鱼胚胎发育的影响.方法 在斑马鱼胚胎1～2细胞期采用显微注射吗啡啉反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonucleotides,MO)的方法下调MMP21基因的表达.10体节期用RT-PCR方法检测MMP21-MO的有效性.设置0.5、0.75、1 mmol/L和1.5 mmol/L 4个不同浓度梯度的MMP21-MO注射组,以标准对照吗啡啉反义寡核苷酸(Con-MO)注射组和野生型(WT)组为对照.体视显微镜下观察各组斑马鱼胚胎发育情况,统计分析不同注射浓度斑马鱼胚胎死亡以及畸形数量.整胚原位杂交检测心脏特异性标志物(cardiac myosin light chain 2,cmlc2)在受精后28 h(hours post fertilization,hpf)及受精后48 h的表达,体视显微镜下观察受精后72 h斑马鱼胚胎心脏,分析各时间点斑马鱼心脏环化情况.通过计数各组斑马鱼胚胎受精后24、48及72 h心率和测量各组胚胎受精后72 h时心室收缩分数(ventricular shortening fraction,VSF),评价MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏功能的影响.结果 MMP21-MO能够有效抑制MMP21基因的表达.MMP21-MO对斑马鱼胚胎发育的影响存在一定的剂量反应关系.1 mmol/L MMP21-MO注射组胚胎畸形率最高,死亡率较低,畸形主要表现为心前区水肿、心脏环化异常、心脏搏动减弱和心率减慢.整胚原位杂交结果显示MMP21基因的表达下调导致心脏特异标志物cmlc2 mRNA在受精后28 h和受精后48 h时期异常表达,提示心脏环化前期阶段(cardiac jogging)和心脏环化(cardiac looping)过程异常.受精后72 h体视显微镜下观察斑马鱼心脏形态同样发现MMP21-MO注射组斑马鱼心脏环化异常.与对照组比较MMP21-MO注射组胚胎心率减慢,心室收缩分数下降.结论 MMP21基因表达下调导致斑马鱼心脏环化异常及心功能受损,MMP21基因可能在斑马鱼心脏环化过程中发挥重要作用.     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

过表达miR⁃155对斑马鱼胚胎发育的影响

目的：探讨过表达miR?155对斑马鱼胚胎发育的影响和机制。方法：利用qRT?PCR检测miR?155在斑马鱼胚胎发育各阶段的表达;通过显微注射的方法将miR?155 mimic转入斑马鱼胚胎,实现基因的过表达;利用qRT?PCR和Western blot方法检测过表达miR?155后发育相关标志性基因的表达变化;利用ETS1的mRNA对过表达miR?155的胚胎进行补救实验。结果：miR?155在胚胎发育时期均有表达,在器官形成期表达量明显增高;过表达miR?155导致斑马鱼胚胎发育迟缓、褪膜延迟、腹部及心包积液、尾部变短变粗,肝脏、小肠、心脏及肌肉发育相关标志性基因表达下调;ETS1能缓解过表达miR?155所致发育畸形。结论：过表达miR?155可能通过负向调控ETS1而影响斑马鱼胚胎肝脏、小肠、心脏及肌肉的发育。     

Supervilin通过Wnt/β-catenin通路调控斑马鱼胚胎集中延伸运动

目的探究Supervillin在斑马鱼胚胎发育过程中的作用及分子机制。方法利用Clustal Omega和DNAman软件,分析比较斑马鱼Svil和人类SVIL氨基酸序列同源性。利用RT-PCR和原位杂交技术,分析斑马鱼Svila(Svil蛋白在斑马鱼体内的亚型)在早期胚胎发育中的表达模式。注射反义吗啡环寡核苷酸链(MO),抑制斑马鱼中Svila表达,观察胚胎形态变化。通过Western Blot技术检测β-catenin蛋白表达与核定位情况,并用RT-PCR检测Wnt/β-catenin靶基因表达。结果在斑马鱼早期胚胎发育过程中,Svila属于母源性表达,随着发育时间呈表达上升趋势。利用MO降低Svila表达,斑马鱼胚胎发育发生畸变,体轴弯曲,可能与胚胎集中延伸运动受阻有关。Svila的表达影响β-catenin的核转运及Wnt/β-catenin信号通路激活。结论 Svila通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控斑马鱼早期胚胎的集中延伸运动。     

二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的影响

目的 以斑马鱼为模型,研究二甲基亚砜(DMSO)对斑马鱼胚胎发育的毒性效应.方法 将受精后3h的斑马鱼卵分别暴露于含有0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％((Ψ))DMSO试液中,观察不同浓度DMSO对鱼卵孵化率、死亡率及畸形情况的影响,评价DMSO对斑马鱼胚胎发育的毒性效应.结果 与对照组相比,在受精后24 h、48 h、72 h、96 h,DMSO浓度≤0.5％对斑马鱼胚胎无明显毒性效应;DMSO浓度≥0.6％时,斑马鱼胚胎在受精后48 h、72 h、96 h孵化率显著下降,死亡率增加并产生大量畸形.结论 用DMSO作为化合物的助溶剂研究化合物对斑马鱼胚胎发育的毒性效应时,应选择DMSO的浓度≤0.5％.     

斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶基因的生物信息学特征及胚胎发育表达

目的 探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶（FPGS）的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式。方法 利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgsmRNA的表达。结果 生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守。RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达。原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48～96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达。结论 斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性...     

小鼠着床前胚胎miR-125a,miR-295和miR-181b的表达

目的：研究小鼠着床前胚胎发育过程中miRNA表达水平的变化，探讨miRNA对着床前胚胎发育过程的作用．方法：建立小鼠超排、交配系统，收集着床前胚胎，提取smallRNA；采用miRNA特异RT引物进行反转录，采用SYBRGreen实时定量PCR技术，研究miR-125a，miR-295和miR-181b在小鼠着床前胚胎发育过程中表达水平的变化．结果：着床前胚胎发育的各阶段均表达miR-125a，miR-295和miR-181b；随着胚胎发育进程，miR-295的表达呈逐渐上升的趋势；miR-125a在卵母细胞到2细胞发育阶段呈下降趋势，以后随发育进程呈逐渐上升趋势．结论：小鼠着床前胚胎中表达miRNA，着床前胚胎的发育和分化过程可能受到miRNA的调控．     

Daxx在斑马鱼胚胎发育中的作用及其机制研究

目的明确死亡结构域相关蛋白（Daxx）在斑马鱼胚胎发育过程中的时-空表达谱,并研究其作用与机制。方法利用原位杂交技术检测Daxx的表达谱;利用吗啉反义寡核苷酸介导的基因敲减技术敲低Daxx的表达,观测斑马鱼胚胎发育情况,并用pH3和TUNEL染色检测Daxx敲低后细胞增殖及凋亡的改变;通过Real—TimePCR实验研究Daxx影响细胞凋亡和胚胎发育的分子机制。结果敲低Daxx后斑马鱼胚胎细胞凋亡和畸形率显著增加,这一表型能被p53蛋白共敲低所恢复;在分子机制上,Daxx敲低可不同程度特异性激活bax、mdm2、p21和cyclinG1等p53下游多个基因的表达,Daxx富含酸性氨基酸的功能区介导rjj述过程。结论Daxx利用其自身结构域与p53作用,并特异调控其下游关键基因的表达,参与调节斑马鱼胚胎细胞凋亡和形念发育。     

ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

目的: 观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法: 利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果: g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义（P > 0.05）;G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义（P > 0.05）。结论: 成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。     

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

目的：选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。     

吉非替尼对斑马鱼胚胎发育及肿瘤耐药基因表达的影响

目的 研究吉非替尼对斑马鱼早期胚胎发育及abcb4肿瘤耐药基因表达的影响.方法 实验动物采用斑马鱼,实验分为吉非替尼组、阿霉素和吉非替尼的混合液组、空白对照组.将吉非替尼稀释成不同浓度梯度的药液,分别处理受精后0.5～1.5 h(0.5～1.5 hpf)的斑马鱼胚胎,观察胚胎和幼鱼的死亡率、孵化率及畸形率变化.统计各浓度不同时间点的胚胎死亡率,计算出IC50的数值;统计48 hpf和72 hpf的胚胎孵化率及120 hpf的畸形率;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量.结果 计算出吉非替尼在斑马鱼胚胎中的IC50为16.18 μmol/L.与对照组比较,高剂量吉非替尼(≥20 μmol/L)显著抑制胚胎的孵化,并有明显的胚胎致死效应和致畸效应;吉非替尼组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平变化不显著,而阿霉素和吉非替尼的混合液组的abcb4基因的mRNA水平有明显变化(P＜0.05).结论 吉非替尼对斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平无明显影响(P＞0.05),但是吉非替尼能逆转易耐药药物阿霉素的耐药作用,提示使用斑马鱼可以构建肿瘤耐药模型.     

Irx5a基因过表达对斑马鱼胚胎早期造血的影响

目的 探讨易洛魁族同源盒5a(Irx5a)基因对斑马鱼胚胎早期造血相关转录调控因子的影响.方法 于斑马鱼胚胎1细胞受精卵期,显微注射Irx5a-EGFP mRNA斑马鱼胚胎作为实验组、显微注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP) mRNA斑马鱼胚胎作为实验对照组、野生型斑马鱼作为空白对照组,应用qPCR检测相关造血转录调控因子在斑马鱼胚胎受精后9 h(9 hpf)、12h、18h、24 h和30 h时相的表达水平.结果 实时荧光定量PCR结果表明,在原始造血转录因子lmo2、scl中,实验组从9 hpf～24 hpf较另外两组间明显减低;在定向造血转录因子中,c-myb实验组从12 hpf～24 hpf较另外两组间明显减低,runx1实验组从9 hpf～30 hpf较另外两组间明显减低;髓系造血转录因子pu.1和红系造血转录调控因子gata-1实验组从9 hpf～30 hpf较另外两组间明显减低,且差异有统计学意义.结论 Irx5a基因在斑马鱼原始造血、成体造血、红系造血、髓系造血的重要转录调控因子中发挥着抑制作用.     

Clec14a基因调控斑马鱼胚胎血管发育*

目的：探索Clec14a在斑马鱼胚胎期的表达及其在血管发育过程中的功能,探讨该基因调控血管发育机制。方法：通过胚胎整体原位杂交技术,观察Clec14a基因在斑马鱼胚胎期的表达情况;在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）和Tg（fli1a:nGFP）中,显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸（morpholinoantisense oligos）下调Clec14a基因表达,同时在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）中注射Clec14a-mRNA调控Clec14a基因表达,利用激光共聚焦显微镜观察分析斑马鱼节间血管（intersegment vessel,ISV）表型,统计分析内皮细胞迁移速度和数目的变化,并应用qRT-PCR技术检测下调后该基因mRNA表达情况。结果：在受精后24 h、48 h和72 h,Clec14a基因在斑马鱼脑、心脏、血管系统中有表达;Clec14a基因表达下调导致ISV发育缺陷,内皮细胞数目减少,抑制其迁移速度。结论：下调Clec14a基因表达能够通过抑制内皮细胞增殖和内皮细胞迁移调控斑马鱼胚胎血管发育。     

核酸染料Goodview、Gelred和Gelsafe对斑马鱼胚胎发育的毒性作用

目的研究核酸染料Goodview、Gelred和Gelsafe对斑马鱼胚胎发育的影响。方法将受精后时间(hpf)为3hpf的斑马鱼胚胎随机分组,分别加入0、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%和0.32%浓度的Goodview、Gelred和Gelsafe 3种核酸染料,观察3种核酸染料对斑马鱼胚胎发育的影响,记录胚胎48 hpf心率,计算72和96 hpf孵化率,96 hpf死亡率及畸形率;同时观察了4、24和48 hpf 3种染料穿透胚胎膜的情况。结果 Goodview、Gelred和Gelsafe 3种核酸染料半数致死浓度(LC50)分别为0.037%、0.092%和0.130%。3种核酸染料0.04%～0.32%浓度组的胚胎48 hpf心率、72和96 hpf孵化率、96hpf死亡率和畸形率与对照组相比都存在显著差异,3种核酸染料96 hpf死亡率、72和96 hpf孵化率还存在剂量-效应关系。Gelsafe 0.08%～0.32%浓度组部分幼鱼出现心囊水肿和脊柱弯曲,0.32%Gelred组染毒后还出现眼点发育不全,Goodview0.04～0.16%浓度组部分幼鱼除心囊水肿和脊柱弯曲外,还出现尾部发育不全等畸形表征。0.01%Goodview 4 hpf能穿透胚胎膜进入胚胎内,随着浓度和时间增加,胚胎内荧光增强。而Gelred和Gelsafe 0.32%浓度下4 hpf未发现明显荧光蓄积点,24hpf和48 hpf仍未发现。结论 3种核酸染料对斑马鱼胚胎发育有毒性,随着使用浓度的增加毒性增加。