汉滩型与希望山型汉坦病毒的体外重组

目的：探明汉坦病毒汉滩型与希望山型之间能否发生巧克力理排，以及发生重排的频率和特点，方法：用汉坦病毒汉滩型76－118株与希望山型PHV株混合感染VeroE6细胞，空斑形成实验挑取子代病毒克隆株，传代培养后用RTPCR方法鉴定子代病毒基因型。结果：子代病毒14／36来源于PHV株；12／36来源于76－118株；5／36汉滩型与希望山型分型引物扩增均为阳性；1株子代病毒L，S片断均来源于76－118株，而M片段两种引物扩增均为阳怀；2株子代病毒L片断来源于76－118株，S片断来源于PHV株，M片段两种引物扩增均为阳性。1株子代病毒L，S片断均来源于76－118株，而M片段来源于PHV株，结论：汉坦病毒汉滩型与希望山型之间可以发生基因片段的重排。     

肾综合征出血热汉坦病毒分型及序列特征的研究

目的 分析黑龙江省肾综合征出血热（HFRS）患者携带汉坦病毒的基因型别及序列特征.方法 采集临床诊断为肾综合征出血热病人的全血60例,其中通过金标法检测出血热特异性抗体阳性40例、阴性20例,血凝块提取汉坦病毒RNA,应用RT-Nest-PCR及核苷酸序列测定分型技术对黑龙江地区的汉坦病毒进行分型研究,设计汉坦病毒M片段通用引物（MOF,MOR）及HTNV和SEOV的M片段特异性引物（HTNMF、HTNMR,SEOMF、SEOMR）,应用Nest-PCR进行扩增,回收阳性扩增产物进行基因序列测定,将所测基因序列与国内外HV病毒株序列进行核苷酸同源性分析,构建M基因种系进化树.结果 出血热特异性抗体阳性的病例中扩增出HTN型19份,抗体阴性的病例中扩增出HTN型1份、SEO型l份.总体来看黑龙江省流行的汉坦病毒毒株主要为HTN型和SEO型,以HTN型为主.经核苷酸及氨基酸同源性和种系进化分析表明其黑龙江地区的病毒株同源性较高,其中HTN型与76 ～ 118株同源性较高,SEO型与Z37株的同源性较高.结论 黑龙江省的HV感染病例多为HTN型,与其他GenBank中的各地标准株的核苷酸及推导的氨基酸序列均有一定差异,在系统进化树中分析HTN型与76-118株较为接近.SEO型与国内Z37较为接近.结合临床症状发现其临床症状较为相似的在系统进化发生树中较为接近.     

汉坦病毒基因重排病毒株毒力变化的初步研究

目的：比较汉坦病毒基因重排病毒L7MSS7格L7MSS7S株与亲代病毒76－118株、SR－11株毒力的差异。方法：选取汉坦病毒基因重排病毒株L7MSS7株和L7MSS7S株，分别接种于Vero E6细胞和乳鼠，观察其在Vero E6细胞中的增殖特性和对乳鼠致死性，并与亲代病毒76－118株、SR－11株进行比较。结果：发现L7MSS7S株在Vero E6细胞中较其他病毒株生长缓慢，接种后14天无一只死亡。L7MSS7株接种于Vero E6细胞中第8天，约3／5的Vero E6细胞脱落，接种后第10天乳鼠存活率75％，较亲代病毒显著增高。结论：证实汉坦病毒基因重排毒株在毒力和生物学特性上与亲代病毒株有显著差异。     

黑龙江省1株汉滩型汉坦病毒的分离及基因鉴定

目的从鼠肺中获得汉坦病毒分离株并进行基因鉴定与分型。方法用组织培养法分离病毒，并进行RT—PCR鉴定，之后对目的片段进行序列测定和序列分析。结果从黑线姬鼠鼠肺中分离到一株汉坦病毒，编号HL83。用汉滩型（HTN）汉坦病毒M基因特异性引物检测得到预计大小的片段，此片段的核苷酸序列分析表明，HL83与HTN型参考毒株的同源性较高，与汉城型（SEO）参考毒株的同源性较低，进化树分析表明HL83位于HTN型所在的支系。结论HL83为HTN型汉坦病毒。     

上海地区汉坦病毒基因分型和序列分析

目的 研究上海地区汉坦病毒基因型分布。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、核苷酸测序法和系统发生树分析上海宿主动物中获得的36株汉坦病毒M基因片段。结果 上海地区郊区和郊县汉坦病毒流行株有HTN型和SEO型，以HTN型为主；市区流行株为SEO型。核苷酸序列同源性及系统发生树分析表明上海地区在HTN型汉坦病毒存在3个不同分支，不同HTN型病毒间的核苷酸的差异在6％～19％。结论 上海地区汉坦病毒以HTN型为主。可能存在汉坦病毒的不同基因亚型，对本市肾综合征出血热的防治有重要指导意义。     

中国湖北地区汉坦病毒M片断基因变异的研究

目的:了解中国湖北地区汉坦病毒的遗传学特征。方法:采集2000~2001年肾综合征出血热(HFRS)患者的血液标本,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增汉坦病毒M片断基因。22例IgM阳性患者中,从5例患者的血凝块中扩增得到特异性PCR产物。结果:对550bp和403bp扩增产物进行的系统进化分析揭示汉坦病毒至少存在3个不同分支。W613株和W1141株与原型株HTN76-118,CUMC-B11(韩国),cl-l和cl-2(日本)同一分支;W1219株和H8205同一分支;另外两株与A9和HV114同一分支。结论:首次发现湖北地区人类汉坦病毒株与韩国和日本的HTN型具有高度序列同源性。     

汉坦病毒湖北株M片段G1编码区基因变异研究

目的 :探讨近年来汉坦病毒HTN湖北株M基因片段G1编码区部分基因序列的变异情况。方法 :根据汉坦HTNM片段G1编码区核苷酸序列设计引物 ,利用RT PCR方法对 75份病程在 7d以内的肾综合症出血热 (HFRS)患者 (经临床诊断和ELISA确诊 )血清标本进行检测 ,并对扩增出的目的基因片段选用 3种限制性内切酶AluⅠ、RsaⅠ、MboⅠ进行酶切 ,根据限制性片段长度多态性分析筛选出变异毒株 ,继而通过序列测定 ,得到变异毒株G1编码区部分核苷酸序列 ,并与标准株HTN76 118及地方株HTN 114的相应核苷酸序列及氨基酸序列进行比较分析。结果 :75份血清标本通过RT PCR方法进行检测 ,阳性率为 77.3 %。扩增片段用 3种限制性内切酶AluⅠ、RsaⅠ、MboⅠ进行酶切分析 ,发现 4份阳性产物其限制性片段长度多态性与HTN 76 118均不相同 ,但其中 3份阳性产物限制性片段长度多态性与地方株HTN 114基本相同 ,1份与HTN 114株不完全相同。对该扩增产物的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析表明 ,其核苷酸序列与标准株 76 118的同源性为 83.3 % ,与地方株HTN 114的同源性为 96 % ;推导氨基酸序列与HTN 76 118的同源性为 93.2 % ,与地方株HTN 114的同源性为 99%。结论 :①近年来引起湖北地区HFRS的主要毒株仍为HTN地方株。②从分析的病     

青岛地区2000～2003年肾综合征出血热的病毒基因分型

①目的 调查山东省青岛地区2000～2003年汉坦病毒的流行情况，研究病毒在该地区的分子流行病学特征。②方法 采集肾综合征出血热(HFRS)急性期病人血清标本64份，提取血清中病毒RNA作为模板，根据GenBank中汉坦病毒基因序列，设计HTN型和SEO型的通用外套引物，同时分别设计HTN型特异性引物和SEO型的特异性引物作为内套引物，RT—nest—PCR扩增汉坦病毒基因组M片段G1区基因序列并测序。测序结果利用DNA Star软件进行核苷酸序列分析。③结果 在64例标本中用HTN型特异性引物扩增阳性6例，占9％；用SEO型特异性引物扩增阳性25例，占39％；总阳性率为48％。总体来看青岛地区流行的汉坦毒株以SEO型为主。SEO型汉坦病毒间核苷酸序列的差异相对较小，在核苷酸序列水平其基因的离散度为0．3％～8．9％。HTN型汉坦病毒的变异率较高，其基因的离散度为2．6％～11．2％。④结论 青岛地区汉坦病毒的流行以SEO型为主，HTN型并存，其中HTN型主要发生在胶南市。     

山东地区汉坦病毒重要基因序列进化关系的研究

目的 :研究山东地区汉坦病毒的基因型分布。方法 :应用RT -PCR法和直接核酸测序法 ,对来源于山东省 11个肾综合征出血热流行地区的患者中获得的 31份汉坦病毒部分M基因片段进行了扩增和测序。结果 :核苷酸序列的同源性及系统发生树分析表明 ,山东地区SEO型汉坦病毒至少存在 4个不同亚型 ,HTN型汉坦病毒至少发现有 4个分支 ,不同HTN型汉坦病毒亚型间的核苷酸序列的差异达 13.0 %～2 2 .7% ,而不同SEO型汉坦病毒分支间相对保守 ,差异仅 5 .0 %～ 7.7%。结论 :山东地区存在汉坦病毒的不同的基因亚型 ,这一发现将促进汉坦病毒流行规律、致病性和疫苗的研究     

汉滩病毒西安分离株84 FLi的S片段全基因序列测定及分析

目的：测定我国陕西西安出血热肾病综合征(HFRS)患者流产胎儿肝分离的病毒84FLi株的全S片段基因序列，了解其分子特征，并确定其在汉坦病毒(HV)种系发生中的位置。方法：采用逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增出S基因的cDNA，直接用PCR产物或克隆入pMD18-T载体中测序。结果：84FLi株的全S基因共由1688个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A31．39％、C19．25％、G23．04％和T26．30％，GC含量为42．29％，AT含量为57．71％。最大开放读码框为37～1326，共编码429个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明，84FLi株与汉滩病毒(HTN)型同源性高于与其他型HTV的同源性。84FLi株与中国毒株Chen4和RG9同属于一个进化分支，而与HTN型国外毒株距离较远，属于不同的进化分支。结论：84FLi株属于HTN，并与国内分离的HTN同源性较高。     

用单克隆抗体对湖北五株流行性出血热病毒抗原性初步检定

本文报导从湖北疫区不同动物宿主分离的5株EHFV,用21个单克隆抗体经间接免疫荧光法对其抗原性进行了比较,5株EHFV均属野鼠型,但彼此间稍有差别,与国内其他省份和南朝鲜76-118等8株比较,抗原决定簇似乎要少些。     

肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６－１１８,３９）Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物和一条探针,按异硫酸氰胍－酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ,采用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６份对照组血清、４０份ＨＦＲＳ急性期（１～５天）血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ,所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０份     

汉滩病毒西安分离84FLi的M片段全基因序列测定及分析

目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒84FLi株的全M片段基因序列，了解其分子基础。方法 采用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），分节段扩增M基因片段的cDNA，直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果 84FLi株的全M基因序列组成为：M片段基因共由3616个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30．92％，C18．03％，G21．18％，T29．87％。GC含量为39．21％，AT含量为60．79％，最大开放读码框为41－3448，共编码1135个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明84FLi株与HTN型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与HV114株的同源性为85．5％。与HTNV的国际标准毒株76－118的核苷酸同源性分别为84．0％，氨基酸的同源性为96．0％。结论 84FLi株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高。     

Effects of Hantaan virus on human endothelial cells and their significance in pathogenesis of hemorrhagic fever with renal syndrome.

The effects of Hantaan virus (HTNV) on human endothelial cells (HECs) were investigated both in vivo and in vitro. The 76-118 strain or SR-11 strain of HTNV were inoculated into HECs monolayers respectively, and the virus antigens could be detected on the seventh day of the first passage after inoculation by immunofluorescent technique. The HTNV could also be isolated through cultures of Vero E-6 cells. HTNV particles and inclusion bodies together with various changes in the organelles were observed in the infected cells by transmission electronic microscopy (TEM), and the immunoenzyme positive virus particles were seen by immunoelectronic microscopy. Samples of skin biopsy were individually obtained from 14 cases of hemorrhagic fever with renal syndrome on the second to the fifth day after the onset of the illness. It was found that HTNV antigens were widely distributed in the cytoplasm of endothelial cells of the samples from 5 out of 14 cases by avidin-biotin-peroxidase complex staining, and morphologic changes of the endothelial cells similar to those observed in vitro, were also seen by TEM. The results indicated that HEC is one of the target cells susceptible to HTNV. The virus could invade and propagate in HECs, and could induce damage to the latter.

     

Seroprevalence study of Hantavirus infection in the community based population

The genus Hantavirus, family Bunyaviridae, comprise at least 20 distinct viruses. Ten of these have been linked to specific human diseases. Hemorrhagic fever with renal syndrome has been recognized since the 1950s. Hantavirus pulmonary syndrome was recognized in the United States in 1993. Epizootiologic studies of Norway rats in the Baltimore area have shown that rodent infections with hantaviruses are common and geographically widespread with prevalence reaching 44% in tested rat populations. These viruses are antigenically related to the Seoul virus. Hantavirus infections in humans occur through transmission from a rodent reservoir, primarily by inhalation of virus laden rodent excreta. There is no evidence to support person-to-person transmission of any known Hantavirus. To establish the prevalence of Hantavirus infections in humans in the Baltimore area we collected sera from 1,212 persons attending a community based health care system. These were tested for antibodies against three reference Hantavirus strains: Hantaan (HTN), Seoul (SEO), and Convict Creek (HN017). HN017 was chosen to represent the SinNombre (SN-like) strains of Hantavirus. Sera from nine patients were positive to Hantavirus specific antibodies, HTN, and SEO by Enzyme Linked Imuno Sorbent Assay (ELISA). No sera were positive for HN017 antigen. All sera that were positive for HTN and SEO were tested by western blot for HTN. All nine sera were confirmed positive by western blot. This suggests that unrecognized infections with Hantaan or Seoul-like viruses occur in the Baltimore area in humans, although the prevalence rate in humans is low (0.74%). Epidemiologic monitoring may be warranted to establish the health implications of these infections.     

流行性出血热患者急性期血清分离病毒及其理化性和血清学鉴定

从湖北省流行性出血热患者急性期血清中以动物接种(ApodemusSylvanticus)和细胞培养(Veto-E_6)方法分离到一株病毒,名之为流行性出血热病毒湖北株(EHF_H)。经部分理化性和抗原性鉴定,同KHF关系密切,同PHV也有交叉关系,同NEV则显示单向交叉。     

Isolation of a strain of Hantaan virus from peritoneal exudate cells of a patient with hemorrhagic fever with renal syndrome.

A new strain of Hantaan virus (HTNV), GH716, was isolated from the peritoneal exudate cells (PEC) of a patient with severe hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). The isolate was propagated in Vero E6 cells. At each passage the virus-infected cells were examined for HTNV with immunofluorescence technique using monoclonal antibodies (McAb) 25-1 and 84-1 against HTNV. From passage 5 on, fluorescent intensity tended to stabilize at (+++) and infectivity titer reached 10(5) TCID50/ml. Using 14 McAb to 76-118 and BI strains of HTNV, we found that strain GH716 was antigenically similar to strain 76-118 (Apodemus type) and different from strain R22 (Rattus type), suggesting that GH716 may fall into the Apodemus type of HTNV. This is the first isolation of an HTNV from human PEC collected on the tenth day of illness. The successful isolation of strain GH716 may provide an alternative source of obtaining HTNV during the later stages of HFRS.