Expression of Beclinl in Osteosarcoma and the Effects of Down-regulation of Autophagy on the Chemotherapeutic Sensitivity

To explore the expression of Beclin1 in osteosarcoma and investigate the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity to cisplatin (DDP),the expression of Beclin1 in 28 specimens of osteosarcoma (group A) and 19 specimens of normal bone tissues (group B) were immunohistochemically detected. The expression of Beclin1 mRNA in MG63 cells treated with different concentrations of DDP was examined with RT-PCR. After down-regulation of autophagy in MG63 cells by an autophagy inhibitor,3-methyladenine (3-MA),the cell proliferation inhibition rate of MG63 cells treated with DDP was evaluated by using the MTT assay. The positive rates of Beclinl were 67.85% in group A and 94.73% in group B. Its expression was lower in osteosarcoma than in normal bone tissues,with a significant difference found between them (P＜0.05).RT-PCR showed that the expression of Bcclin1 mRNA in the cells treated with high-dose DDP were higher than that in the non-treated cells,and no significant difference in the expression of Beclin1 mRNA was found between the cells treated with low-dose DDP and the non-treated cells. There was a positive correlation between the level of Beclin1 mRNA expression and the concentration of DDP.MTT assay showed that the proliferation inhibition rates of the cell treated with 3-MA and DDP combined were substantially increased when compared with those treated with DDP alone (P＜0.01).This study demonstrated that autophagy may be implicated in the carcinogenesis of osteosarcoma,and DDP may induce autophagy in the MG63 cells. It also suggests that the down-regulated autophagy could increase chemotherapeutic sensitivity of DDP to osteosarcoma.     

顺铂诱导骨肉瘤细胞自噬及其与凋亡关系的体外研究

目的研究顺铂(DDP)诱导的骨肉瘤细胞自噬性活化,并探讨自噬与凋亡的关系。方法利用免疫荧光染色和电镜观察DDP对骨肉瘤细胞自噬的影响;应用3-甲基腺嘌呤(3MA)下调自噬,采用MTT比色法,测定DDP对骨肉瘤细胞增殖抑制率的影响;MDC荧光染色和流式细胞术定量检测骨肉瘤细胞自噬的表达;应用流式细胞仪检测骨肉瘤细胞的凋亡情况。结果 DDP给药后可见LC3-Ⅱ绿色荧光呈点状散在分布于细胞膜附近。电镜下观察到DDP给药后骨肉瘤细胞内自噬体的形成。DDP能诱导自噬和凋亡的发生。3MA能抑制自噬的发生,对凋亡无明显影响。与单独DDP作用相比,3MA提前给药细胞的凋亡率增加,其细胞增殖抑制率也增高;3MA迟后给药细胞的凋亡率略有下降,其细胞增殖抑制率也下降。结论 DDP能诱导MG63细胞发生自噬性活化。DDP作用早期,自噬能延缓凋亡的发生,发挥保护细胞的作用;在DDP作用后期,自噬则作为另一种死亡形式出现,和凋亡一起促进细胞死亡。     

3-甲基腺嘌呤增强口腔鳞癌体外化疗药物敏感性的作用机制

目的：通过在口腔鳞癌Tca83细胞培养过程中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）,观察顺铂（DDP）对口腔鳞癌Tca83细胞的杀伤作用,探讨3-MA增强口腔鳞癌化疗药物敏感性的作用机制。方法： 将对数生长期口腔鳞癌Tca83细胞分为对照组、3-MA处理组、DDP处理组、3-MA+DDP处理组和DDP+3-MA处理组,用MTT法检测细胞生存率,激光共聚焦显微镜检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：Tca83细胞株对顺铂IC₅₀值为5 mg/L;MTT检测,DDP组细胞生存率显著低于对照组和DDP+3-MA组 (P<0.05),高于3-MA+ DDP组 (P<0.05);细胞免疫荧光检测,3-MA组平均荧光强度显著低于其他4组（P<0.05）;流式细胞术检测,DDP组细胞凋亡率显著低于3-MA+DDP组 (P<0.05),高于DDP+3-MA组 (P<0.05)。结论：不同水平的自噬对口腔鳞癌细胞的作用不同,抑制细胞自身基础水平的自噬可增强DDP对Tca83细胞的杀伤作用,提示自噬抑制剂有望成为口腔鳞癌的化疗增敏剂。     

紫铆因通过自噬途径促进骨肉瘤细胞凋亡及机制研究

目的研究紫铆因对骨肉瘤细胞凋亡及自噬的影响,并探讨自噬在紫铆因抗骨肉瘤中的作用。方法分别以不同浓度紫铆因作用骨肉瘤细胞24h和30滋mol/L紫铆因作用骨肉瘤细胞不同时间,使用CCK-8试剂盒测定细胞活性变化;Westernblot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleavedcaspase3及自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin-1的表达情况;TUNEL染色检测骨肉瘤细胞的凋亡情况;透射电子显微镜检测自噬泡的产生;最后分别用自噬激动剂和自噬抑制剂预处理后再加入紫铆因作用于骨肉瘤细胞,并重复上述实验。结果紫铆因作用后,骨肉瘤细胞的活性明显下降,Bax、Cleavedcaspase3、Beclin-1、LC3II的表达增加,而Bcl-2、p62的表达降低,骨肉瘤细胞出现明显的凋亡现象,透射电子显微镜观察到紫铆因处理组有较多自噬泡产生;使用自噬抑制剂预处理骨肉瘤细胞后,紫铆因对骨肉瘤的凋亡效果被逆转,而使用自噬激动剂预处理骨肉瘤细胞后,紫铆因使骨肉瘤细胞凋亡的效果进一步增强。结论紫铆因可以降低骨肉瘤细胞活性并促进其凋亡;同时紫铆因可以激活自噬,促进骨肉瘤细胞凋亡。     

抑制miR-30a/HMGA2介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗诱导的细胞凋亡的作用

目的：探讨微小RNA(microRNA,miR)-30a/高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗(以下简称化疗)药物诱导的细胞凋亡的影响。方法：随机选取30例经化疗药物治疗后表现为化疗敏感和化疗抵抗的骨肉瘤患者组织,分为化疗敏感组(n=15)和化疗抵抗组(n=15),采用real-time PCR检测两组中miR-30a和HMGA2的mRNA表达水平,以及骨肉瘤细胞U2-OS经不同浓度的化疗药物(顺铂、阿霉素、氨甲蝶呤)处理后miR-30a的mRNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关因子Beclin 1,自噬微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、自噬抑制因子P62的表达情况。在骨肉瘤细胞U2-OS中转染miR-30a模拟物和抑制剂,构建miR-30a高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况;采用单丹磺酰尸胺(monodansylcada,MDC)染色法检测细胞内自噬水平,ROS荧光探针-二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)检测细胞内ROS水平,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡程度,线粒体膜电位荧光探针JC-1检测细胞线粒体氧化损伤程度;采用双荧光素酶法检测miR-30a与HMGA2的相互作用,同时通过转染HMGA2模拟物和HMGA2-shRNA干扰质粒载体,构建HMGA2高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况。结果：化疗抵抗组中miR-30a的mRNA水平显著低于化疗敏感组(P<0.05),HMGA2的表达与miR-30a相反(均P<0.05)。在相对低浓度(5 μml/L)的化疗药物刺激下,骨肉瘤细胞U2-OS内的miR-30a mRNA表达下调,Beclin 1和LC3B均显著上调(均P<0.01),P62显著下调(P<0.01)。在miR-30a高表达组中,与对照组相比,Beclin 1和LC3B的表达水平与miR-30a明显下降(P<0.05),P62的表达水平明显升高(P<0.05),在miR-30a低表达组中则相反;在经过化疗药物处理后的miR-30a高表达组中,细胞自噬水平更低,细胞存活率更低,ROS水平更高,线粒体氧化损伤程度更高,细胞凋亡水平更高(均P<0.05),miR-30a低表达组则相反(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测验证了miR-30a与HMGA2的靶向互补配对关系;与对照组相比,HMGA2高表达组中Beclin 1和LC3B的表达水平与HMGA2明显升高(P<0.05),P62的表达水平明显下降(P<0.05),在HMGA2低表达组中则相反。结论：积极发挥miR-30a/HMGA2抑制骨肉瘤细胞自噬的功能,能够破坏细胞应对ROS介导的自噬与凋亡的平衡,增强化疗药物对细胞的杀伤作用。     

Targeted silencing of heparanase gene by small interfering RNA inhibits invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells

The effects of targeted silencing of heparanase gene by small interfering RNA(siRNA) on invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells(MG63 cells) were investigated in the present study.Two complementary oligonucleotide strands were synthesized and inserted into pGenesil-1 vector based on the mRNA sequence of heparanase gene.The expression vector containing short hairpin RNA(pGenesil-shRNA) was constructed successfully.MG63 cells were randomly allocated into 3 groups:blank group,empty vector(pGenesil) transfected group and expression vector(pGenesil-shRNA) transfected group.Under the induction of Lipofectamine 2000,the recombinants were transfected into MG63 cells.Heparanase gene expression level was detected by RT-PCR and Western blotting.Cell prolifera-tion was measured by MTT assay.Cell invasiveness and metastasis were examined by cell adhesion and Transwell-ECM assays.HUVECs migration assay was applied for the detection of angiogenesis.As compared with negative controls,the mRNA and protein expression levels of heparanase were down-regulated by 76.1%(P<0.01) and 75.3%(P<0.01) respectively in the pGenesil-shRNA transfected group.Meanwhile,the proliferation,adhesiveness,invasiveness and angiogenesis properties of MG63 cells were all significantly inhibited.It was suggested that targeted silencing of heparanase gene by siRNA could dramatically inhibit the invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells.     

低分子质量肝素联合顺铂对肝癌细胞自噬的影响

目的：探讨低分子质量肝素(low molecular weight heparin, LMWH)联合顺铂(cisplatin, DDP)对BEL-7404人肝癌细胞自噬的影响和机制。方法：用不同质量浓度的LMWH、DDP单独或联合处理肝癌BEL-7404细胞48 h,并分为4组：对照组、LMWH组、DDP组及L+D组。CCK-8法测其对细胞增殖能力的影响;单丹磺酰尸胺荧光染色法观察自噬水平;RT-PCR检测自噬蛋白mRNA的表达;Western blotting检测自噬蛋白及通路蛋白的表达。结果：L+D组的细胞增殖能力较其他组明显下降(P<0.01),绿色荧光自噬体显著增多、自噬相关蛋白LC3Ⅱ的mRNA和蛋白表达均明显增高(P<0.01),p62明显降低(P<0.01),P-AMPK/AMPK、P-ULK1/ULK1以及Beclin1的蛋白表达明显升高(P<0.05～P<0.01)。结论：LMWH与DDP联合作用显著提高了BEL-7404细胞自噬,可能是通过激活AMPK-ULK1-Beclin1信号通路而实现。     

三氧化二砷诱导人骨髓瘤细胞RPMI8226自噬及凋亡关系的研究

目的通过引入自噬及凋亡抑制剂观察三氧化二砷（As2O3）作用于骨髓瘤细胞RPMI 8226引起自噬和凋亡之间的关系。方法①MTT法计算细胞生长抑制率。②流式细胞仪检测RPMI 8226细胞的自噬率及凋亡率的变化。③通过Western Blot方法检测不同实验组Beclin-1及Caspase-3表达的变化。结果①各浓度As2O3对人骨髓瘤细胞RPMI 8226都显示出明显的生长抑制作用（P〈0.05）,且呈时间-剂量依赖性。②与As2O3单独处理组相比,3-MA预处理组,As2O3诱导RPMI 8226细胞凋亡率呈下降趋势,有统计学意义（P〈0.05）;zVAD-fmk与As2O3联合处理组,凋亡率未见明显变化（P〉0.05）。与As2O3单独处理组相比,3-MA预处理组,As2O3诱导RPMI 8226细胞自噬率下降,有统计学意义（P〈0.05）;zVAD-fmk与As2O3联合处理组As2O3诱导RP-MI8226细胞自噬率亦下降,有统计学意义（P〈0.05）。③与As2O3单独加药组比较,3-MA预处理组As2O3诱导RPMI 8226细胞Procaspase-3蛋白表达明显升高,Beclin-1表达下降;zVAD-fmk预处理组亦表现为Procaspase-3蛋白表达明显升高,Beclin-1下降。结论①不同浓度组As2O3作用24、48、72h对RPMI8226细胞的增殖均有明显的抑制作用（P〈0.05）,且该作用成时间-剂量依赖关系。②As2O3可诱导RPMI 8226细胞发生凋亡及自噬,两者的关系表现为互为前提。抑制任何一方都会导致另一方过程受抑。③As2O3诱导RPMI 8226细胞凋亡过程中可能存在Caspase非依赖型细胞凋亡程序。     

IL-17A/IL-17RA通过上调自噬降低卵巢癌SKOV3细胞对顺铂敏感性

目的 探讨白细胞介素（IL）17A通过调控细胞自噬对卵巢癌细胞顺铂（DDP）化疗敏感性的影响。方法 体外培养卵巢癌SKOV3细胞并分别用不同浓度DDP（1、2、4、6、8、10、15、20 μg/mL）处理,MTT法测定细胞增殖活性以及IL-17A（100 ng/mL,处理24 h）对DDP 诱导SKOV3细胞凋亡的影响;流式细胞术检测人卵巢癌细胞SKOV3中IL-17A受体（IL-17RA）的表达水平;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测细胞早期凋亡情况;IL-17RA 中和抗体（IL-17RA mAb）进行IL-17RA阻断实验;合成针对IL-17RA基因的siRNA片段（siRNA-IL-17RA）,转染SKOV3细胞,沉默IL-17RA表达;3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制细胞自噬水平;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白（Bcl2、Bax、Cleaved Caspase3）、自噬相关蛋白（P62、Beclin-1）表达。结果 DDP可以增加卵巢癌SKOV3细胞IL-17RA表达水平;IL-17A降低SKOV3细胞对DDP的敏感性（P<0.05）;DDP诱导SKOV3细胞内自噬相关蛋白Beclin-表达增强,自噬降解底物P62蛋白减少;IL-17A/IL-17RA增强了DDP自噬诱导作用（P<0.05）;3-MA 阻断自噬后,SKOV3细胞凋亡率较干扰前明显升高,细胞抗凋亡蛋白Bcl2表达水平降低、凋亡蛋白Bax表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 IL-17A/IL-17RA可能通过上调DDP诱导的自噬水平降低人卵巢癌SKOV3细胞化疗敏感性。     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤增强鼻咽癌细胞对放射和化学治疗的敏感性

目的：探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)增强鼻咽癌细胞对放射治疗(放疗)和化学治疗(化疗)敏感性的作用及其相关的分子机制。方法：采用MTT法检测3-MA对细胞的增殖抑制作用;集落克隆形成法检测3-MA对细胞集落克隆形成的影响;Annexin V/PI双染法、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、DAPI染色检测细胞凋亡;Western 印迹检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、自噬相关蛋白beclin1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)表达。结果：不同体积浓度或剂量的顺铂(cisplatin,DDP)、电离辐射(ionizing radiation,IR)、衣霉素(tunicamycin,TM)、3-MA对鼻咽癌细胞HONE-1均具有增殖抑制作用,且随着体积浓度或剂量的增加和作用时间的延长,对HONE-1细胞增殖抑制作用随之增加。经1.00mmol/L 3-MA预处理细胞后,再次给予6.00 μmol/L DDP,4.00 Gy IR,1.00 μmol/L TM处理,细胞存活率明显降低,均低于单用组,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。3-MA增强DDP,IR,TM抑制细胞集落克隆形成作用。用6.00 μmol/L DDP或4.00 Gy IR处理HONE-1细胞24 h后,细胞凋亡率分别为5.8%和6.7%,与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。JC-1和DAPI染色显示3-MA增强DDP,IR或TM诱导的细胞凋亡作用;Western 印迹结果显示DDP,IR或TM处理组GRP78,beclin1表达呈时间依赖性上调,LC3 I向LC3 II转化,3-MA预处理组beclin1表达明显降低,LC3 I向LC3 II的转化。结论：自噬抑制剂3-MA可增强鼻咽癌细胞对放化疗的敏感性,其机制可能与3-MA抑制内质网应激诱导的自噬所产生的保护作用相关。     

MiR-650通过靶向ING4促进骨肉瘤细胞增殖的研究

目的 探讨骨肉瘤组织和细胞系中miR-650的表达及其在肿瘤形成中的作用机制.方法 用实时荧光定量 PCR的方法,检测并比较肿瘤组织及癌旁正常组织、骨肉瘤细胞系(M G63)及健康人成骨细胞(hFOB1.19)之间的miR-650表达情况;用M T T实验检测不同组细胞的增殖情况;用Western blot的方法检测调节生长抑制因子4(ING4)蛋白的表达情况.结果miR-650在骨肉瘤组织及细胞系中的表达显著高于癌旁正常组织及健康人成骨细胞;抑制miR-650的表达后,M G63细胞的增殖能力显著减弱.此外,miR-650表达减低后,ING4的表达显著升高,其中阴性对照组、乱序组、miR-650抑制剂组的ING4 mRNA分别为1.00 ± 0.16、1.08 ± 0.14、5.35 ± 0.32;蛋白表达分别为:0.62 ± 0.06、0.59 ± 0.12、2.45 ± 0.20;miR-650抑制组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);而抑制ING4升高后,M G63细胞的增殖能力有一定的恢复.结论 miR-650可以通过降低ING4的表达促进M G63细胞的增殖,提示miR-650可能成为骨肉瘤治疗的新靶点.     

黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡

目的研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组。除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理。用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P0.05)。与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P0.05)。结论黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。     

姜黄素对顺铂抑制人成骨肉瘤细胞MG63增殖的影响

目的研究姜黄素对顺铂抑制人成骨肉瘤细胞MG63增殖的影响。方法采用噻唑蓝比色法检测姜黄素和顺铂不同浓度组合时对MG63细胞增殖的影响,荧光倒置显微镜观察药物作用后细胞形态的改变,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。结果随着姜黄素和顺铂的药物浓度逐渐升高,单药对MG63细胞的增殖抑制率呈上升趋势(P<0.05)。两药联合作用后细胞明显变形、发泡,细胞凋亡数进一步增加,细胞排列更加紊乱,大量细胞脱落悬浮于培养液中。结论不同浓度的姜黄素对顺铂抑制人成骨肉瘤细胞MG63增殖的影响不一样,可以是拮抗、相加或协同。     

核仁素表达下调对顺铂诱导人骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖抑制和凋亡的影响

目的:观察核仁素(C23)表达下调对顺铂(DDP)诱导人骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖抑制和凋亡的影响。方法:将细胞随机分为5组:对照组、DDP组、S+DDP组(转染C23正义寡核苷酸后再用DDP)、AS+DDP(转染C23反义寡核苷酸后再用DDP)与R+DDP(转染随机寡核苷酸后再用DDP);用MTT法检测各组细胞增殖率;用Western印迹和RT-PCR检测各组C23,Bcl-2和Bax蛋白与mRNA的表达;用DAPI染色方法和流式细胞术检测各组细胞凋亡核百分率、细胞凋亡率。结果:C23反义寡核苷酸显著抑制了C23蛋白和mRNA的表达,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);AS+DDP组与DDP组比较,细胞增殖率下降约18%(P<0.01),C23与Bcl-2蛋白和mRNA表达均降低(P<0.01),但Bax表达增高(P<0.01);细胞凋亡核百分率与细胞凋亡率均增高(P<0.01)。结论:C23表达下调能促进DDP诱导的SaOS-2细胞增殖抑制和凋亡。     

DOT1L对骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响及其作用机制

目的 探讨抑制组蛋白H3赖氨酸79（H3K79）甲基转移酶DOT1L基因对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移、DNA损伤的影响及可能的作用机制。方法将hDOT1L-shRNA质粒转染至骨肉瘤MG63细胞（hDOT1L-shRNA组）,同时设置shRNA阴性对照组（Scramble组）。采用实时荧光定量PCR检测DOT1L mRNA的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法和彗星实验检测细胞DNA损伤。Western blot检测MG63细胞中DOT1L、H3K79me2、Histone H3、Sirt1、XPA蛋白的表达水平。结果转染后,与Scramble组相比,hDOT1L-shRNA组MG63细胞中DOT1L mRNA及蛋白表达水平下调（P<0.05）,细胞增殖能力降低（P<0.05）,细胞迁移率降低（P<0.05）,DNA损伤程度加剧（P<0.05）。Western blot检测结果显示,与Scramble组相比,hDOT1L-shRNA组MG63细胞中细胞Histone H3总量差异无统计学意义(P>0.05),其他DOT1L、H3K79me2、Sirt1、XPA蛋白表达水平均降低。结论DOT1L可能通过DOT1L/H3K79me2-SIRT1-XPA信号通路抑制骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移并诱导其DNA损伤。     

细胞自噬在三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究

【摘要】 目的 研究细胞自噬在三氧化二砷（ATO）诱导的肝癌细胞死亡中的作用,观察调控细胞自噬对ATO诱导的细胞凋亡有何影响。方法 以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在ATO作用于HepG2细胞的基础上,加入自噬激动剂〔雷帕霉素（Rap）〕和自噬抑制剂〔三甲基腺嘌呤（3-MA）〕进行调控。以MTT法检测细胞生存率,透射电镜观察自噬体结构,免疫印迹法分析自噬相关蛋白LC-3和Beclin1的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 5~20 μmol/L ATO与10 mmol/L 3-MA联用时HepG2细胞存活率比同剂量ATO单独作用时降低（P <0.05）,凋亡率增加（P <0.05）,细胞内呈现典型凋亡反应特征,自噬蛋白LC3和Beclin1表达低于ATO单独作用组（P <0.05）。相反,5~20 μmol/L ATO与0.25 μmol/L Rap联用时,HepG2细胞的存活率比ATO单独作用时显著增加（P <0.05）,凋亡率降低（P <0.05）,细胞内出现大量自噬体结构,自噬蛋白LC3和Beclin1的表达较ATO单独作用组有增加趋势,但差异无统计学意义（P >0.05）。结论 特异性自噬抑制剂能显著增强ATO杀伤肝癌细胞的敏感性,其机制与增强肝癌细胞凋亡有关。     

自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用

目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.     

下调Notch3表达对骨肉瘤细胞生物学特性的影响

目的 观察Notch3在骨肉瘤细胞中的表达及下调Notch3表达后对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,探讨Notch3在骨肉瘤细胞生物学功能中的作用.方法 体外培养人骨肉瘤细胞MG63、Saos2、U20S,采用Real-time PCR和Western blot检测3种骨肉瘤细胞系中Notch3的mRNA和蛋白表达水平;利用siRNA敲低Notch3在骨肉瘤U20S细胞中的表达,并将细胞分为siNotch3组和阴性对照组,检测下调Notch3的表达后骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭、迁移等生物学特性的变化.结果 Notch3在骨肉瘤细胞MG63、Saos2、U20S中均呈阳性表达,并且在低级别骨肉瘤细胞系MG63中的表达明显低于高级别细胞系Saos2和U20S(P ＜0.05),下调Notch3的U20S细胞(siNotch3组)增殖、侵袭、迁移能力较阴性对照组减弱,凋亡率增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在骨肉瘤细胞U20S中下调Notch3的表达可明显抑制细胞的增殖、侵袭、迁移能力,促进凋亡.Notch3可能是Notch 通路在骨肉瘤中的关键受体之一,并参与了骨肉瘤的发生、发展.     

二膦酸盐对人骨肉瘤细胞诱导凋亡作用的实验研究

目的：探讨二膦酸盐对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制。方法将人骨肉瘤M G‐63细胞株培养、传代后将细胞分为两组：二膦酸盐400μg／m L干预组、生理盐水空白对照组,孵育72 h后,对两组人骨肉瘤M G‐63细胞株行免疫荧光检测,观察两组细胞中凋亡因子Caspase‐3、Fas的表达;行流式细胞术检测,观察两组细胞的细胞凋亡率。结果二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG‐63细胞株72 h后,免疫荧光检测结果可见二膦酸盐400μg／mL干预组细胞中凋亡因子Caspase‐3、Fas大量表达,而生理盐水空白对照组几乎见不到凋亡因子Caspase‐3、Fas的表达;流式细胞术检测结果观察到二膦酸盐400μg／mL干预组细胞的细胞凋亡率为54．00％,远大于生理盐水空白对照组的细胞凋亡率3．10％,差异有统计学意义（ P＜0．05）,存在明显的诱导凋亡现象。结论二膦酸盐对体外人骨肉瘤M G‐63细胞株存在很强的诱导凋亡作用。     

细胞自噬对紫杉醇诱导宫颈癌CaSki细胞死亡的影响

目的：通过对自噬基因Beclin1的表达调节来观察细胞自噬对紫杉醇诱导人宫颈癌CaSki细胞株死亡的影响,并探讨在该过程中自噬与凋亡之间的相互作用及关系。方法：利用脂质体法将Beclin1的过表达质粒pcDNA3.1-Beclin1和RNA干扰质粒pSUPER-Beclin1分别体外转染CaSki细胞并筛选稳定表达株后,电镜下观察细胞内自噬囊泡的形成,Western 印迹检测转染前后Beclin1与LC3蛋白的表达变化。上述细胞株经紫杉醇作用后MTT法检测细胞增殖情况的改变,流式细胞仪检测自噬细胞与凋亡细胞的百分率。结果：在Beclin1基因过度表达的CaSki细胞株中,电镜观察到细胞内存在大量的自噬囊泡;Beclin1与LC3蛋白的表达在pcDNA3.1-Beclin1转染细胞株中被上调。MTT法检测提示Beclin1过表达细胞株存活细胞明显少于未转染对照细胞株。流式细胞仪检测提示经紫杉醇作用后与空白对照组比较,Beclin1过表达组自噬细胞与凋亡细胞百分率均有明显增加,其中凋亡增加尤其明显;而Beclin1干扰组自噬细胞与凋亡细胞百分率均有所减少。结论：在紫杉醇对宫颈癌CaSki细胞株的杀伤过程中细胞自噬与凋亡均发挥了作用,在Beclin1基因过度表达的CaSki细胞株中可通过增加紫杉醇诱导的细胞凋亡来增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用。