内质网应激-自噬反应在顺铂诱导宫颈癌HeLa细胞死亡中的作用

目的研究内质网应激-自噬反应在顺铂诱导宫颈癌HeLa细胞死亡中的作用,以及自噬基因Beclin 1对HeLa细胞顺铂敏感性的影响。方法不同浓度顺铂作用HeLa细胞后,丹磺酰戊二胺染色法观察细胞中自噬体的形成,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin 1和LC3的表达及内质网应激相关蛋白IRE1、PERK和ATF6的表达。将自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Beclin1转染HeLa细胞,Western blot检测Beclin 1在HeLa细胞中的蛋白表达,噻唑蓝比色(MTT)法检测顺铂对HeLa细胞半数抑制浓度(IC50)的变化,流式细胞仪检测凋亡细胞的百分率。结果顺铂作用HeLa细胞后,细胞内自噬体形成增加,自噬蛋白Beclin 1和LC3表达增加,且均呈现时间依赖性(P<0.05),内质网应激相关蛋白IRE1、PERK和ATF6的表达增强。pcDNA3.1(+)-Beclin1转染HeLa后,Beclin 1蛋白表达增加(P<0.05);MTT检测IC50由转染前的1.0μg/ml下降到0.5μg/ml;凋亡细胞百分率升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论内质网应激-自噬反应参与了顺铂对宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性作用,自噬基因Beclin 1过表达能够增加HeLa细胞对顺铂的敏感性。     

Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

目的：探讨Tob1对肾上腺皮质癌细胞自噬的作用及其影响。方法：将体外培养的SW-13细胞分为对照组、空载质粒转染组以及pcDNA3.1-Tob1质粒转染组。实时荧光定量PCR检测各组细胞中Tob1的mRNA表达。Western blot检测Tob1以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin 1的表达。LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。随后在转染pcDNA3.1-Tob1质粒的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理,CCK-8检测细胞增殖,Tunel检测细胞凋亡。结果：pcDNA3.1-Tob1质粒转染显著上调SW-13细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达,提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1水平,降低p62蛋白表达,并显著提升细胞自噬水平(P<0.05)。与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组SW-13细胞增殖降低,细胞凋亡增加;与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖提升,细胞凋亡降低(P<0.05)。结论：Tob1能够通过激活细胞自噬降低人皮质癌细胞SW-13增殖并促进其凋亡。     

真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响

目的:构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1,检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后,外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达,并观察其对HEC细胞增殖的影响。方法:通过RT-PCR和T/A克隆等方法,构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1,并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中,通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC中表达的情况,并设立实验组(转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体)、空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)、空白脂质体对照组,用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况,MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等,研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。结果:经限制性内切酶鉴定及测序,证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确,将其转染HEC细胞,转染后的HEC细胞在体外能继续增殖,但增殖能力明显下降。结论:Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功,并能在HEC细胞中表达,转染HEC细胞体外增殖能力明显降低,Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

自噬基因Beclin 1在SKOV3细胞中的表达及其调控相关信号传导途径的研究

目的探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达后自噬相关信号调控通路PI3K/PKB途径中ClassⅠPI3K（p110α）、p-PKB和ClassⅢPI3K（hvps34）的表达变化以及对肿瘤细胞的自噬活性的影响.方法将自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞;分别用荧光定量RT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平检测用流式细胞仪检测Beclin1、p110α、hvps34和p-PKB的表达;在电镜和荧光显微镜下观察自噬现象,用流式细胞仪检肿瘤细胞自噬情况.结果 pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞Beclin1表达在mRNA和蛋白质水平明显高于转染空质粒pcDNA3.1和未转染细胞;PcDNA3.1/Beclin1转染后hvps34表达上调,而p110α、p-PKB的表达下调.PcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在在电镜下可见大量自噬囊泡形成.在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC阳性细胞明显增加.流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%.结论自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可使ClassⅢPI3K（hvps34）表达上调,ClassⅠPI3K（p110α）及其下游的p-PKB表达下调,诱导肿瘤细胞自噬活性增加,抑制SKOV3在体外的增殖.     

电离辐射对Beclin1过表达和低表达MCF-7细胞模型细胞自噬和凋亡的影响及其调控机制

目的:建立Beclin 1过表达和低表达MCF-7细胞模型,检测4 Gy照射后细胞自噬和凋亡的变化,探讨Beclin 1的分子调控作用机制。方法:实验分为MCF-7组、MCF-7+4Gy组、MCF-7-Beclin1+4Gy组和MCF-7-Belin1 RNAi+4Gy组。利用分子生物学方法构建Beclin 1过表达载体pcDNA3.1-Beclin 1,并建立Beclin 1过表达和低表达细胞模型。细胞经4 Gy照射后,采用MDC染色荧光显微镜观察自噬细胞百分比,AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式细胞术检测凋亡细胞百分比,Western blotting法检测Beclin 1、P53、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:与MCF-7组比较,MCF-7+4 Gy组、MCF-7-Beclin 1+4 Gy组和MCF-7-Beclin 1 RNAi+4 Gy组自噬和凋亡细胞百分比均明显升高(P<0.05 或 P<0.01),以MCF-7-Beclin 1+4 Gy组升高最明显,且高于MCF-7+4 Gy组 (P<0.05);各组坏死细胞百分比无明显差异。4 Gy照射后,MCF-7组和MCF-7-Beclin 1组细胞中Beclin 1、P53和Bax蛋白表达水平均升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,且以MCF-7-Beclin 1组最为明显。结论:成功建立Beclin 1过表达和低表达MCF-7细胞模型,电离辐射能够诱导其细胞自噬和凋亡,且对Beclin 1过表达细胞作用更明显。Beclin1通过激活P53,进而抑制Bcl-2和激活Bax,从而形成以P53为中心的自噬与凋亡分子调控机制。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

COX-2抑制剂塞来昔布对肝癌小鼠CD4+CD25+调节T细胞的影响

【摘要】 目的探讨帕金森氏病相关蛋白Pink1在自噬过程的作用。方法采用RT-PCR扩增基因片段,构建Pink1﹑自噬抑制蛋白Bcl-XL和自噬激活因子Beclin1等重组质粒,并通过慢病毒系统建立稳定表达Pink1-Flag的HEK293细胞株,通过重组质粒转染细胞,过表达相关蛋白,用免疫共沉淀和Western blot检测Pink1和Bcl-XL的相互作用,Pink1对Bcl-XL和Beclin1相互作用的影响,以及Pink1对自噬的影响。结果自噬抑制蛋白Bcl-XL与Pink1有相互作用,过量表达Pink1可以抑制Bcl-XL与自噬激活因子Beclin1的相互作用。过量表达Pink1提高自噬下游蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。结论帕金森氏病相关蛋白Pink1通过与自噬抑制蛋白Bcl-XL相互作用释放自噬促进因子Beclin1来激活自噬。     

帕金森氏病相关蛋白Pink1促进自噬的研究

目的 探讨帕金森氏病相关蛋白Pink1在自噬过程的作用.方法 采用RT-PCR扩增基因片段,构建Pink1、自噬抑制蛋白Bcl-XL和自噬激活因子Beclin1等重组质粒,并通过慢病毒系统建立稳定表达Pink1-Flag的HEK293细胞株,通过重组质粒转染细胞,过表达相关蛋白,用免疫共沉淀和Western blot检测Pink1和Bcl-XL的相互作用,Pink1对Bcl-XL和Beclin1相互作用的影响,以及Pink1对自噬的影响.结果 自噬抑制蛋白Bcl-XL与Pink1有相互作用,过量表达Pink1可以抑制Bcl-XL与自噬激活因子Beclin1的相互作用.过量表达Pink1提高自噬下游蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ.结论 帕金森氏病相关蛋白Pink1通过与自噬抑制蛋白Bcl-XL相互作用释放自噬促进因子Beclin1来激活自噬.     

高迁移率族蛋白B1对宫颈癌细胞化学治疗敏感性的影响及其机制

目的：探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)对宫颈癌细胞化学治疗敏感性 的影响及其机制。方法：采用Western印迹法检测宫颈癌细胞HeLa和CaSki经不同药物浓度顺铂处理后LC3, Beclin1及P62的表达水平,检测使用自噬抑制剂和/或顺铂处理后宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3,Beclin1及P62 的表达水平;采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖水平。构建HeLa-shHMGB1,CaSki- shHMGB1,HeLa-CTR及CaSki-CTR的稳定细胞系。以CCK-8检测上述细胞系顺铂半数抑制浓度(half maximum inhibitory concentration,IC50)水平;Western印迹法检测上述细胞系中HMGB1, LC3,Beclin1及P62的表达水 平。结果：在一定浓度范围内,随着顺铂药物浓度的增加,宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3及Beclin1的表达 增加,P62表达降低。与单用顺铂组相比,顺铂联合自噬抑制剂组细胞存活率更低(P<0.05)。在宫颈癌细胞 中,HMGB1的表达与顺铂药物敏感性有关(P<0.05),与LC3,Beclin1表达呈正相关,与P62表达呈负相关。 结论：HMGB1可能通过调控宫颈癌细胞内自噬的水平,影响其对顺铂的敏感性。铂类药物结合自噬抑制剂可能成为 宫颈癌治疗的新策略。HMGB1可能成为预测化学治疗药物敏感性的分子标志物。     

沉默Beclin1基因对β-榄香烯抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖与诱导自噬的影响

目的探讨Beclin1基因对β-榄香烯抗人胃癌SGC-7901细胞增殖及自噬诱导的影响。方法用前期实验构建成功的GV112-Beclin1-shRNA1(short hairpin RNA,短发夹RNA)慢病毒载体感染人胃癌SGC-7901细胞。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测β-榄香烯对SGC-7901细胞增殖的抑制作用,以及沉默Beclin1基因后对β-榄香烯抗增殖能力的影响。免疫蛋白印迹(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3-II、P62的表达,评价β-榄香烯作用SGC-7901后的自噬水平和Beclin1基因沉默对β-榄香烯诱导自噬的影响。结果 MTT法显示,β-榄香烯能够抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,抑制作用随浓度的增加而递增(浓度为20、50、100μg/mL比0μg/mL时,抑制率为21.5%、31.7%、37.4%比0,P<0.05);沉默Beclin1基因后β-榄香烯抑制胃癌SGC-7901细胞抑制率增加(42.3%比36.1%,P<0.05)。Western blot法显示,β-榄香烯能诱导SGC-7901细胞发生保护性自噬,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达上调,P62蛋白表达下降,沉默Beclin1基因可抑制β-榄香烯对SGC-7901细胞保护性自噬的增强,LC3-Ⅱ蛋白表达水平下降,P62蛋白表达增加。结论β-榄香烯可诱导胃癌SGC-7901细胞发生保护性自噬,下调Beclin1基因有助于降低保护性自噬的发生,从而增强β-榄香烯的抗癌效果。     

高尔基体磷蛋白3通过促进细胞自噬抑制紫杉醇诱导的hela细胞凋亡

目的 探讨紫杉醇处理hela细胞时,高尔基体磷蛋白3（Golph3）对细胞自噬的调控和对紫杉醇引起的细胞凋亡的影响。方法 通过慢病毒感染的方法上调hela细胞中Golph3的表达;通过转染siRNA方法下调hela细胞中Golph3的表达;使用透射电镜观察细胞中的自噬小体;免疫印记检测自噬标记物LC3II的蛋白表达水平;通过流式细胞仪检测细胞凋亡率;使用自噬抑制剂 3-MA抑制 hela细胞自噬。结果 Golph3慢病毒可上调 hela细胞 Golph3蛋白表达,siRNA可抑制 hela细胞 Golph3蛋白表达。透射电镜观察结果显示,Golph3过表达组细胞自噬小体的数量增多,siRNA组细胞自噬小体的数量减少。免疫印迹结果显示,Golph3组细胞中自噬标记物LC3II表达增强,p62表达减弱;siRNA组LC3II表达抑制,p62表达增强。凋亡检测结果显示,Golph3组紫杉醇诱导的细胞凋亡率下降（P<0.01）,siRNA组细胞凋亡率上升（P<0.01）。自噬抑制剂3-MA单独处理不会显著增加hela细胞凋亡率。3-MA处理同时下调Golph3表达可以促进紫杉醇引起的细胞凋亡（P<0.01）。结论 紫杉醇处理hela细胞时,上调Golph3促进hela细胞自噬,抑制细胞凋亡;下调Golph3抑制hela细胞自噬,促进细胞凋亡。Golph3通过调控细胞自噬影响紫杉醇引起的hela细胞凋亡。     

大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响

目的 构建大鼠CB1(rCB1)基因真核表达载体 ，检测rCB1基因在细胞中的表达，研究rCB1对Caski细胞凋亡的影响。方法 从大鼠脑组织中提取总RNA，RT-PCR扩增rCB1基因, 通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与pCDNA3.1( )质粒，构建pcDNA3.1( )-rCB1。脂质体法将其转染到HEK293和Caski细胞，Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测CB1的表达及定位，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot与实时荧光定量PCR检测rCB1、Bcl-2、Bax、Bad的表达。结果 酶切重组质粒获得5300bp的载体片段和1500bp的目的片段，测序结果和rCB1基因序列（NM_012784.4）一致。转染HEK293细胞后， rCB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Caski细胞后， rCB1使细胞凋亡率增加（P<0.05）； rCB1基因上调Bax、Bad的表达，同时抑制Bcl-2的表达，与空白组比较，其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了pcDNA3.1( )/rCB1真核表达载体, rCB表达于细胞膜和细胞质， rCB1可以明显促进宫颈癌Caski细胞的凋亡，其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2的表达。     

Beclin1基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用

目的 探讨Beclinl基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用.方法 采用RNA干扰技术抑制Beclinl表达,Beclinl被抑制后细胞的存活能力通过MTT实验评估;结直肠癌细胞SW620在血清剥夺状态下自噬活性通过LC3蛋白水平评估;分别经血清剥夺、星孢菌素及依托泊苷处理的SW620凋亡率通过流式细胞仪检测;Beclinl表达情况经Western blot评估.结果 pSUPER-Becl组细胞血清剥夺后存活能力显著降低(P＜0.05),在血清剥夺24 h后,空白对照组和pSUPER-non组抗凋亡能力比pSUPER-Becl组更强(P＜0.05),星孢菌素处理后,pSUPER-Becl组细胞凋亡最为显著(P＜0.05),用依托泊苷处理后得到相似的结果(P＜0.05);pSUPER-non组与空白对照组细胞中Beclinl的表达随血清剥夺时间的延长呈现上调趋势(P＜0.05),这与LC3的表达变化相一致;而pSUPER-Becl组LC3的表达显著减少(P＜0.05).结论 Beclin1是结直肠癌细胞中自噬和凋亡的关键调节因素,并且维持凋亡和自噬的平衡;Beclinl通过调节细胞自噬活性,在结直肠癌发展与演进中作为一种保护机制,使肿瘤细胞免受到低营养和化疗所致的损伤而持续生存.     

Expression of Beclin1 in osteosarcoma and the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity

To explore the expression of Beclin1 in osteosarcoma and investigate the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity to cisplatin （DDP）, the expression of Beclin1 in 28 specimens of osteosarcoma （group A） and 19 specimens of normal bone tissues （group B） were immunohistochemically detected. The expression of Beclin1 mRNA in MG63 cells treated with different concentrations of DDP was examined with RT-PCR. After down-regulation of autophagy in MG63 cells by an autophagy inhibitor, 3-methyladenine （3-MA）, the cell proliferation inhibition rate of MG63 cells treated with DDP was evaluated by using the MTT assay. The positive rates of Beclin1 were 67.85% in group A and 94.73% in group B. Its expression was lower in osteosarcoma than in normal bone tissues, with a significant difference found between them （P〈0.05）. RT-PCR showed that the expression of Beclin1 mRNA in the cells treated with high-dose DDP were higher than that in the non-treated cells, and no significant difference in the expression of Beclin1 mRNA was found between the cells treated with low-dose DDP and the non-treated cells. There was a positive correlation between the level of Beclin1 mRNA expression and the concentration of DDP. MTT assay showed that the proliferation inhibition rates of the cell treated with 3-MA and DDP combined were substantially increased when compared with those treated with DDP alone （P〈0.01）. This study demonstrated that autophagy may be implicated in the carcinogenesis of osteosarcoma, and DDP may induce autophagy in the MG63 cells. It also suggests that the down-regulated autophagy could increase chemotherapeutic sensitivity of DDP to osteosarcoma.     

Expression of Beclinl in Osteosarcoma and the Effects of Down-regulation of Autophagy on the Chemotherapeutic Sensitivity

To explore the expression of Beclin1 in osteosarcoma and investigate the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity to cisplatin (DDP),the expression of Beclin1 in 28 specimens of osteosarcoma (group A) and 19 specimens of normal bone tissues (group B) were immunohistochemically detected. The expression of Beclin1 mRNA in MG63 cells treated with different concentrations of DDP was examined with RT-PCR. After down-regulation of autophagy in MG63 cells by an autophagy inhibitor,3-methyladenine (3-MA),the cell proliferation inhibition rate of MG63 cells treated with DDP was evaluated by using the MTT assay. The positive rates of Beclinl were 67.85% in group A and 94.73% in group B. Its expression was lower in osteosarcoma than in normal bone tissues,with a significant difference found between them (P＜0.05).RT-PCR showed that the expression of Bcclin1 mRNA in the cells treated with high-dose DDP were higher than that in the non-treated cells,and no significant difference in the expression of Beclin1 mRNA was found between the cells treated with low-dose DDP and the non-treated cells. There was a positive correlation between the level of Beclin1 mRNA expression and the concentration of DDP.MTT assay showed that the proliferation inhibition rates of the cell treated with 3-MA and DDP combined were substantially increased when compared with those treated with DDP alone (P＜0.01).This study demonstrated that autophagy may be implicated in the carcinogenesis of osteosarcoma,and DDP may induce autophagy in the MG63 cells. It also suggests that the down-regulated autophagy could increase chemotherapeutic sensitivity of DDP to osteosarcoma.