B7修饰的肿瘤细胞疫苗体内外抗肿瘤作用

目的：研究小鼠Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用，方法：应用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７－１和Ｂ７－２导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ－６细胞株中，Ｇ４１８筛选后获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素处理制备成肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ），观察ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对不同肿瘤细胞系的抗瘤活性及对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用。结果：（１）ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对亲本肝癌细胞和小鼠     

转B7—1基因的人多发性骨髓细胞XG—7在激发杀肿瘤细胞CTL？…

为调查Ｂ７－１分子在人多发性骨髓瘤细胞的表达是否可诱导出具有抗肿瘤作用的ＣＤ＾＋８的ＣＴＬ，我们用含Ｂ７－１基因逆转录病毒载体ＰＴＧ５１９２的包装细胞２９３Ｅ培养上清，感染人多发性骨髓瘤细胞系ＸＧ－７（不表达Ｂ７－１分子）用新霉素Ｇ４１８选择并经流式细胞仪筛选，获得了稳定高表达式Ｂ７－１分子的ＸＧ－７细胞（命名为ＸＧ－７－Ｂ７细胞）在体外增殖实验中，ＸＧ－７－Ｂ７细胞显示出比母系细胞ＸＧ－７对外周     

γ射线诱导人肝癌细胞表达B7—1共刺激分子的研究

目的 研究电离辐射与肿瘤细胞Ｂ７－１分子表达之间的关系，探讨肿瘤细胞辐粕免疫原性增强的机制。方法 采用间接免疫荧光－流式细胞仪分析技术，研究在用不同剂量γ射线照射ＳＳＭ－７７２肝癌细胞后，培养不同时间内ＳＭＭＣ－７７２细胞Ｂ７－共刺激分子的表达水平。并用＾３Ｈ－ＴｄＲ释放法测定照向射肿瘤细胞与人反应后的细胞知性。结果 未燠才经１０、２０、３０Ｇｙ照射的人肝癌细胞不表达Ｂ７－１分子经４０、５０、６０     

CD40培养体系的建立及B淋巴细胞的体外培养

采用自行研制成的功能性抗人ＣＤ４０单克隆抗体、转导ＣＤ３２的Ｌ细胞（ＬＣＤ３２）和细胞因子建立体外研究人Ｂ淋巴细胞增殖、生长和分化的ＣＤ４０系统。方法：①流式细胞仪分析ＣＤ４０分子的表达;②在ＣＤ４０激发型单抗（克隆５Ｃ１１）与ＬＣＤ３２共培养中,加入ＩＬ－４及其它细胞因子,组成ＣＤ４０培养系统,观察人扁桃体来源Ｂ细胞的体外生存和增殖等生物学效应。结果：①ＣＤ４０分子表达于人外周血、扁桃体来源的Ｂ细胞及人多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞株ＸＧ２和人Ｂ淋巴瘤细胞株Ｄａｕｄｉ;②用ＣＤ４０激发型单抗（克隆５Ｃ１１和２Ｇ１１）与ＬＣＤ３２细胞联合ＩＬ－４能使静止期Ｂ细胞体外长期生存和增殖。表明用激发型ＣＤ４０单抗５Ｃ１１和２Ｇ１１建立的ＣＤ４０培养体系,能使Ｂ细胞长期生存和增殖,为体外研究Ｂ细胞提供了有效的手段。     

重组B7-1/B7-2逆转录病毒载体的构建及其在小鼠肝癌基因治疗中的应用

目的构建表达Ｂ７－１／Ｂ７－２的重组逆转录病毒载体，并观察Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达对体内外抗小鼠肝癌免疫反应的影响。方法粘端定向克隆构建重组逆转录病毒载体ＬＸＳＮ－ｍＢ７－１和ＬＸＳＮ－ｍＢ７－２，依次转导包装细胞系ＰＥ５０１和ＰＡ３１７，并用重组病毒上清感染小鼠肝癌细胞系Ｈｅｐａｌ－６，流式细胞术检测Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达，并用Ｂ７－１／Ｂ７－２表达阳性的Ｈｅｐａｌ－６在体内外诱导抗肿瘤免疫反应。结果１．表达Ｂ７－１／Ｂ７－２阳性的Ｈｅｐａｌ－６致瘤性明显降低；２．单独Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染仅能诱导部分细胞毒性和部分保护性免疫反应；３．Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染与细胞因子处理联合应用则能诱导强烈的细胞毒性和完全的抗Ｈｅｐａｌ－６保护性免疫反应。结论Ｂ７－１／Ｂ７－２共刺激分子在小鼠肝癌的表达是激活抗肿瘤免疫所必需的但不是充分的条件，而Ｂ７基因转染联合ＩＦＮ－γ等细胞因子处理能诱导彻底的抗肿瘤免疫反应     

抗B7-1功能性单克隆抗体对B淋巴瘤细胞生长的抑制作用

目的　分析抗B7- 1功能性单克隆抗体对表达B7分子的人恶性淋巴瘤细胞株Raji和Daudi细胞体外生长的抑制作用及其可能机制。方法　采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析肿瘤细胞的B7- 1分子表达 ;以不同浓度抗B7- 1功能性单克隆抗体 ,加入体外培养细胞中 ,经细胞计数和MTT法 ,观察单克隆抗体对肿瘤细胞体外生长的作用。结果　Raji和Daudi细胞均表达B7- 1分子 ,表达阳性百分率分别为 92 .7%和 89.2 % ;抗B7- 1单克隆抗体浓度在 5 μg/ml时就对这两种细胞株有显著的抑制作用 ,并随浓度增高而增强。 结论　抗B7- 1单克隆抗体对高表达B7- 1分子的人恶性淋巴瘤细胞体外生长有明显的抑制作用 ,这种抑制作用是通过诱导肿瘤细胞的凋亡所致     

B细胞活化因子B7—1cDNA的克隆及其在白血病细胞的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从ＥＢＶ转化Ｂ淋巴细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ、酶切Ｂ７－１基因和逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，连结、克隆ＰＬＢ７－１ＳＮ到大肠杆菌Ｍｃ１０６１。扩增纯化质粒ＰＬＢ７－１ＳＮ。用ＰＡ３１７细胞包装病毒，ＮＩＨ３Ｔ３细胞筛查病毒滴度，获得高效价的Ｂ７－１病毒上清，病毒感染人白血病细胞株Ｋ５６２和ＨＬ６０，获得稳定表达Ｂ７－１分子的肿瘤细胞。     

TIL细胞对不同肿瘤细胞的细胞毒活性研究

Ｂ７分子是提供协同刺激信号的重要分子，包括Ｂ７－１，其相应配体为ＣＥ２８。ＣＴＬＡ－４。Ｂ７－１分子与ＣＤ２８结合后能诱导协同刺激信号的产生，癌性胸水来源的淋巴细胞体外用重组人ＩＬ－２激活后，对肿瘤细胞也具有较强的细胞毒性，也被认为是一类ＴＩＬ。     

B7-1基因修饰的肿瘤细胞瘤苗抗小鼠胃癌效应的实验研究

探讨Ｂ７－１基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗对小鼠胃癌的治疗效果。方法：在已建立高表达Ｂ７－１分子的小鼠前胃癌细胞系ＭＦＣ－Ｂ７的基础上,观察ＭＦＣ－Ｂ７细胞体外激活脾淋巴细胞的能力,体内成瘤性变化及作为瘤苗对荷瘤鼠胃癌的治疗效果。结论：Ｂ７－１基因修饰的肿瘤细胞免疫原性明显增强,有希望作为瘤苗用于此类肿瘤的治疗。     

B7修饰的肿瘤细胞疫苗体内外抗肿瘤作用

目的：研究小鼠Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用。方法：应用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７１和Ｂ７２导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株中，Ｇ４１８筛选后获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素处理制备成肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ），观察ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对不同肿瘤细胞系的抗瘤活性及对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用。结果：①ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对亲本肝癌细胞和小鼠ＮＫ敏感的Ｙａｃ１细胞的体外细胞毒作用明显增强；②在免疫模型中，经ＴＣＶＢ７免疫的小鼠，能对同系肝癌细胞产生完全的免疫保护作用，并能保持无瘤状态长期存活；③在早期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，能部分产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用，肿瘤的生长速度减缓，荷瘤小鼠的生存期延长。肿瘤组织（尤其是肿块包膜下）中淋巴细胞浸润增加；④在晚期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，未能产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用。结论：Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗能明显刺激增强体内外抗肿瘤作用。     

CD40培养体系的建立及B淋巴细胞的体外培养

采用自行研制成的功能性人ＣＤ４０单克隆抗体，转导ＣＤ３２的Ｌ细胞和细胞因子建立体外研究人Ｂ淋巴细胞增殖，生长和分化的ＣＤ４０系统。方法（１）流式细胞仪分析ＣＤ４０分子的表达；（２）在ＣＤ４０激发型单抗与ＬＣＤ３２共培养中，加入ＩＬ－４及其它细胞     

共刺激分子CD28和B7在关节炎发病中的作用

目的：探讨Ｂ７;ＣＤ２８共刺激信号在关节炎发病机制中的作用。方法：经牛Ⅱ型的（ＢⅡＣ）诱导ＳＤ大鼠建立关节炎动物模型,分析抗Ｂ７－１和抗Ｂ７－２抗体对关节炎大鼠临床症状和特异性免疫反应的影响。结果：抗Ｂ７－１抗体可阻止ＳＤ大鼠发生胶原诱地性关节炎,降低大鼠对ＢⅡＣ的体液免疫反应。结论：Ｂ７;ＣＤ２８共刺激信号在诱发Ｔ细胞介导的自身免疫疾病中起作用,抗Ｂ７－１抗体具有潜在的治疗作用。     

B7—1基因转当小鼠EL—4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素

目的 研究Ｂ７－１基因转染小鼠ＥＬ－４淋巴瘤体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素－２。方法 以ＣＴＩＬ－２细胞检测ＥＬ－４Ｂ７－１＾＋免疫小鼠的脾细胞与癌细胞共育的ＭＬＴＣ培养上清中的ＩＬ－２活性。结果 ＥＬ－４Ｂ７－１＾＋免疫小鼠的ＳＰＬ经瘤细胞在体外刺激可诱生出明显的ＩＬ－２活性,而ＥＬ－４免疫小鼠的ＳＰＬ则无此作用,两者具有较明显的差异（Ｐ〈０．０１）。结论 Ｂ７－１基因转染小鼠ＥＬ－４淋巴瘤可在体外诱导免疫小鼠脾细胞产生较高水平的白细胞介素－２。     

EB病毒与原发性鼻咽部B细胞性淋巴瘤有关与继发性者无关

目的：对１９例鼻咽部Ｂ细胞性恶性淋巴瘤与ＥＢ病毒（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）感染的相关性进行研究。方法；利用免疫组织化学及原位杂交方法对ＥＢＶ进行检测，并用免疫组化及原位杂交双染法标记肿瘤细胞，以鉴定ＥＢＶ阳性的细胞为Ｂ淋巴瘤细胞，结果：ＥＢＶ编码的小ｍＲＮＡ探针（ＥＢＥＲ）原位杂交显示，８例原发性鼻咽部Ｂ细胞恶性淋巴瘤中３例绝大多数肿瘤细胞呈阳性表达，１例潜在性膜蛋白１（ｌａｔ     

共刺激信号B7—1表达对小鼠肿瘤细胞生长和转移的影响

为Ｂ７１分子基因在肿瘤免疫基因治疗中的应用提供实验依据。方法通过逆转录病毒介导的基因转移技术，将Ｂ７１ｃＤＮＡ导入具有不同免疫原性的小鼠肿瘤细胞获得表达，并观察转基因细胞在纯系小鼠体内生长和转移的改变。结果由于Ｂ７－１基因的转导表达，使具有免疫原性的ＥＬ４Ｔ淋巴瘤细胞致瘤性丧失；使非免疫原性的Ｂ１６黑色素瘤、Ｐ８１５肥大细胞瘤和ＭＡ８９１乳腺癌细胞的致瘤性减弱；使Ｂ１６细胞的实验性转移和ＭＡ８９１细胞的自发肺转移能力降低。通过转导Ｂ７－１基因的Ｂ１６细胞的免疫接种，可使再次接种的亲本Ｂ１６细胞的致瘤性减弱：但对已生长的亲本Ｂ１６细胞影响不明显。结论Ｂ７１基因导入不同的肿瘤细胞后，可引起机体产生不同程度抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞在体内的生长和转移能力丧失或减弱，这种反应的强弱与肿瘤细胞本身的特性有关。     

内毒素对体外培养人角膜基质细胞表达核转录因子NF-κB的影响

目的：探讨角膜基质细胞在内毒素作用下表达核转录因子ＮＦκＢ的情况。方法：取体外培养的２～３代人角膜基质细胞，分别加入０．２、１．０、５．０、２５ｍｇ·Ｌ－１内毒素培养６ｈ；１．０ｍｇ·Ｌ－１内毒素培养１．５、３、６、１２、２４ｈ，采用免疫荧光抗体染色，流式细胞仪计数的检测方法，观察ＮＦκＢ的表达水平。细胞爬片经免疫荧光染色后摄像。结果：角膜基质细胞ＮＦκＢ的基础表达率为９．４％。内毒素作用后，随时间和浓度递增，于６ｈ和药物质量浓度为５ｍｇ·Ｌ－１时最高，阳性率分别为２１．７％和４８．０％，其后下降。用药前，核转录因子分布于细胞浆内。内毒素作用后，细胞浆内ＮＦκＢ增多，核内也出现阳性表达。结论：核转录因子ＮＦκＢ存在于体外培养的人角膜基质细胞中，能够被内毒素激活，可能是角膜炎症过程中的一种重要调控因素     

协同刺激因子B7在药物性间质性肾炎和IgA肾病间质损伤中的作用

目的探讨协同刺激因子Ｂ７介导的免疫反应在药物性间质性肾炎和ＩｇＡ肾病间质损伤发生中的作用。方法应用免疫组织化学方法对药物性间质性肾炎,ＩｇＡ肾病伴肾小管间质损伤（ＩｇＡＮ）患者和正常人肾组织中协同刺激因子Ｂ７－１和Ｂ７－２,ＨＬＡ－ＤＲ抗原以及ＣＤ４＋和ＣＤ８＋细胞的分布进行了观察和分析。结果间质性肾炎患者肾间质ＣＤ４＋和ＣＤ８＋细胞浸润明显增加,表达Ｂ７－１和Ｂ７－２的细胞显著增多,同时伴肾小管上皮细胞ＨＬＡ－ＤＲ和Ｂ７－１表达的增加。ＩｇＡＮ患者肾间质中ＣＤ４＋和ＣＤ８＋细胞较正常人增多,表达Ｂ７－１的细胞无明显差异。肾小管上Ｂ７－１的表达有所增加,但ＨＬＡ－ＤＲ的表达不增加。结论药物性间质性肾炎和ＩｇＡＮ患者肾小管及间质免疫损伤的表现形式及发生机理存在着差异。     

特异性体外扩增人γδT淋巴细胞及其生物学特性的研究

探讨人γδＴ淋巴细胞体外特异性激发的方法，及其杀伤肿瘤细胞的分子机理。方法采用人多发性骨髓瘤细胞株ＸＧ－７细胞作为刺激细胞，与人外周血单个核细胞体外共同培养，激发和扩增人γδＴ淋巴细胞。以流式细胞仪或间接免疫荧光技术分析细胞表型；再以５１Ｃｒ４小时释放试验检测γδＴ淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。结果（１）采用本培养系统，可以使来自健康人或肿瘤患者的外周血γδＴ淋巴细胞得以选择性激发和扩增，由４．８％±３．４％增加至４６．０％±８．３％，在白细胞介素２（ＩＬ－２）的作用下，能迅速、大量地增殖，３周内可达１０１０以上数量级。（２）所扩增的γδＴ淋巴细胞，对肿瘤细胞株（天然杀伤细胞敏感株Ｋ５６２和淋巴因子激活的杀伤细胞敏感株Ｄａｕｄｉ）皆可介导高效杀伤活性，而对正常淋巴母细胞则无明显细胞毒作用。（３）抗热休克蛋白（ＨＳＰ）－７０单克隆抗体可阻断γδＴ淋巴细胞对ＸＧ－７细胞的反应。结论本室建立的人γδＴ淋巴细胞体外激发、扩增的方法，具有简便、迅速、重复性好的特点，对肿瘤细胞具有广谱的细胞毒活性，在肿瘤的过继免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。     

一步及半巢式PCR检测石蜡包埋B细胞淋巴瘤组织克隆性IgH重排的比较

目的：建立一种简便有效的方法,来检测Ｂ细胞非霍奇金淋巴瘤（Ｂ－ＮＨＬ）石蜡包埋组织的免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因重排。方法：以ＩｇＨ的第三互补决定簇区（ＩｇＨ－ＣＤＲ３）为标志,用消化煮沸法和酚－氯仿法提取３６例Ｂ－ＮＨＬ及１０例扁桃体炎的石蜡包埋组织的基因组ＤＮＡ,比较两进行一步及半巢式聚合酶链反应（ＳｎＰＣＲ）,聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后检测克隆性ＩｇＨ重排的结果。结果：Ｂ－ＮＨＬ组,３４例经酚－氯仿法提取ＤＮＡ,其一步及ＳｎＰＣＲ检测克隆性ＩｇＨ－ＣＤＲ３重排的阳性率分别为２６．５％和７６．５％（Ｐ〈０．０５）;２７例经消化煮沸法提取ＤＮＡ,其一步及ＳｎＰＣＲ的阳性率分别为７．４％和６６．７％（Ｐ〈０．０５）;２５例同时用上述２种方法提取ＤＮＡ,ＳｎＰＣＲ的阳性率分别为７６％和６８％（Ｐ〉０．０５）。对     

人B7.2cDNA的克隆及其核表达

为克隆人Ｂ７．２ｃＤＮＡ，构建Ｂ７．２真核表达质粒，并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞，经ＬＰＳ诱导后，以ＲＴ－ＰＣＲ，克隆Ｂ７．２ｃＤＮＡ；构建真核表达质粒ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ－Ｂ７．２，转染哺乳细胞，进行表达。结果成功克隆了Ｂ７．２ｃＤＮＡ，并经测序证实：所构建的Ｂ７．２抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经ＬＰＳ诱导的人淋巴细胞可表达Ｂ７．２ｍＲＮＡ，所建立的ｐＢＣＭ