青岛地区2000～2003年肾综合征出血热的病毒基因分型

①目的 调查山东省青岛地区2000～2003年汉坦病毒的流行情况，研究病毒在该地区的分子流行病学特征。②方法 采集肾综合征出血热(HFRS)急性期病人血清标本64份，提取血清中病毒RNA作为模板，根据GenBank中汉坦病毒基因序列，设计HTN型和SEO型的通用外套引物，同时分别设计HTN型特异性引物和SEO型的特异性引物作为内套引物，RT—nest—PCR扩增汉坦病毒基因组M片段G1区基因序列并测序。测序结果利用DNA Star软件进行核苷酸序列分析。③结果 在64例标本中用HTN型特异性引物扩增阳性6例，占9％；用SEO型特异性引物扩增阳性25例，占39％；总阳性率为48％。总体来看青岛地区流行的汉坦毒株以SEO型为主。SEO型汉坦病毒间核苷酸序列的差异相对较小，在核苷酸序列水平其基因的离散度为0．3％～8．9％。HTN型汉坦病毒的变异率较高，其基因的离散度为2．6％～11．2％。④结论 青岛地区汉坦病毒的流行以SEO型为主，HTN型并存，其中HTN型主要发生在胶南市。     

汉滩病毒西安分离84FLi的M片段全基因序列测定及分析

目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒84FLi株的全M片段基因序列，了解其分子基础。方法 采用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），分节段扩增M基因片段的cDNA，直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果 84FLi株的全M基因序列组成为：M片段基因共由3616个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30．92％，C18．03％，G21．18％，T29．87％。GC含量为39．21％，AT含量为60．79％，最大开放读码框为41－3448，共编码1135个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明84FLi株与HTN型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与HV114株的同源性为85．5％。与HTNV的国际标准毒株76－118的核苷酸同源性分别为84．0％，氨基酸的同源性为96．0％。结论 84FLi株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高。     

上海地区汉坦病毒基因分型和序列分析

目的 研究上海地区汉坦病毒基因型分布。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、核苷酸测序法和系统发生树分析上海宿主动物中获得的36株汉坦病毒M基因片段。结果 上海地区郊区和郊县汉坦病毒流行株有HTN型和SEO型，以HTN型为主；市区流行株为SEO型。核苷酸序列同源性及系统发生树分析表明上海地区在HTN型汉坦病毒存在3个不同分支，不同HTN型病毒间的核苷酸的差异在6％～19％。结论 上海地区汉坦病毒以HTN型为主。可能存在汉坦病毒的不同基因亚型，对本市肾综合征出血热的防治有重要指导意义。     

山东地区汉坦病理重要基因序列进化关系的研究

目的：研究山东地区汉坦病毒的基因型分布。方法：应用RT－PCR法和直接核酸测序法，对来源于山东省11个肾综合征出血热流行地区的患者中获得的31份汉坦病毒部分M基因片段进行了扩增和测序。结果：核苷酸序列的同源性及系统发生树分析表明，山东地区SEO型汉坦病毒至少存在4个不同亚型，HTN型汉坦病毒至少发现有4个分支，不同HTN型汉坦病毒亚型间的核苷酸序列的差异达13．0％－22．7％，而不同SEO型汉坦病毒分支间相对保守，差异仅5．0％－7．7％。结论：山东地区存在汉坦病毒的不同的基因亚型，这一发现将促进汉坦病毒流行规律、致病性和疫苗的研究。     

汉滩病毒西安分离株84 FLi的S片段全基因序列测定及分析

目的：测定我国陕西西安出血热肾病综合征(HFRS)患者流产胎儿肝分离的病毒84FLi株的全S片段基因序列，了解其分子特征，并确定其在汉坦病毒(HV)种系发生中的位置。方法：采用逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增出S基因的cDNA，直接用PCR产物或克隆入pMD18-T载体中测序。结果：84FLi株的全S基因共由1688个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A31．39％、C19．25％、G23．04％和T26．30％，GC含量为42．29％，AT含量为57．71％。最大开放读码框为37～1326，共编码429个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明，84FLi株与汉滩病毒(HTN)型同源性高于与其他型HTV的同源性。84FLi株与中国毒株Chen4和RG9同属于一个进化分支，而与HTN型国外毒株距离较远，属于不同的进化分支。结论：84FLi株属于HTN，并与国内分离的HTN同源性较高。     

肾综合征出血热汉坦病毒分型及序列特征的研究

目的 分析黑龙江省肾综合征出血热（HFRS）患者携带汉坦病毒的基因型别及序列特征.方法 采集临床诊断为肾综合征出血热病人的全血60例,其中通过金标法检测出血热特异性抗体阳性40例、阴性20例,血凝块提取汉坦病毒RNA,应用RT-Nest-PCR及核苷酸序列测定分型技术对黑龙江地区的汉坦病毒进行分型研究,设计汉坦病毒M片段通用引物（MOF,MOR）及HTNV和SEOV的M片段特异性引物（HTNMF、HTNMR,SEOMF、SEOMR）,应用Nest-PCR进行扩增,回收阳性扩增产物进行基因序列测定,将所测基因序列与国内外HV病毒株序列进行核苷酸同源性分析,构建M基因种系进化树.结果 出血热特异性抗体阳性的病例中扩增出HTN型19份,抗体阴性的病例中扩增出HTN型1份、SEO型l份.总体来看黑龙江省流行的汉坦病毒毒株主要为HTN型和SEO型,以HTN型为主.经核苷酸及氨基酸同源性和种系进化分析表明其黑龙江地区的病毒株同源性较高,其中HTN型与76 ～ 118株同源性较高,SEO型与Z37株的同源性较高.结论 黑龙江省的HV感染病例多为HTN型,与其他GenBank中的各地标准株的核苷酸及推导的氨基酸序列均有一定差异,在系统进化树中分析HTN型与76-118株较为接近.SEO型与国内Z37较为接近.结合临床症状发现其临床症状较为相似的在系统进化发生树中较为接近.     

广州地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因序列分析

目的：探讨广州地区呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因变异的生物学意义，为研究广州地区BSV感染特点及RSV疫苗提供依据。方法：用PT—PCR的方法从广州地区呼吸道合胞病毒分离株98159株的细胞培养物中扩增出编码其表面蛋白G的基因片段，克隆至pGEM—T载体中并进行序列测定。结果：序列测定结果与A亚型原型株A2抹、1990年中国北京地区分离株B79G蛋白的核苷酸序列比较核苷酸同源率分别为92．7％及98．4％；由核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源率分别为88.3％及97．0％。一些重要的免疫反应位点发生了变异。结论：RSVG蛋白抗原结构变异大，在研制疫苗时应注意选用株的地区性。     

应用套式RT—PCR对山东省近年流行的汉坦病毒基因分型的初步研究

目的 研究山东省近年流行的汉坦病毒的基因型别,为山东省汉坦病毒的防治提供依据。方法 使用McAb-IFA,HI分型,R-PCR型技术及核苷酸序列测定技术,对来源于山东省各主要HFRS疫区的98份病人血清进行基因分型,对部分标本PCR产物纯化,采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定,最后用DNA STAR对核苷酸序列进行分析比较。结果 26份恢复期血清中McAb-IFA分型22份为SEO型,HI分型24份SEO型;72份急性期病人血清标本中65例RT－PCR分型为SEO型,获得了来自不同地市汉坦病毒5个样品SEO型;72份急性期病人血清标本中65例RT－PCR分型为SEO型,获得了来自不同地市汉坦病毒5个样品M片段（1343－1630nt)序列;序列比较分析发现,山东省内流行的SEO型汉坦病毒核苷酸的同源性较高,型间差异一般不超过7％,从种系发生树看这些病毒分布在一个分支上,表现出明显的地理聚集现象。结论 近年流行的汉坦病毒仍以SEO型为主,且病毒间同源性较高,故基因重排不是造成近几年HFRS流行的主要原因。     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白基因表达载体的构建及表达

摘要：目的构建汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达载体并将其在Vero E6细胞中进行表达,观察细胞融合现象。方法采用PCR和基因克隆技术,将GM04 38株G1、G2基因分别克隆到表达载体pCAGGS／MCS,酶切和测序鉴定正确后,将表达载体pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共转染Vero E6细胞,酸性MEM处理后观察细胞融合现象的产生,并以间接免疫荧光试验(IFA)观察糖蛋白的表达情况。结果显示在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2,IFA显示荧光信号分布在细胞浆中。二者的共表达可产生良好的生物学活性,在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合,而转染pCAGGS-NP的细胞没有融合现象发生。共表达也未出现明显的促进效应。结论成功构建了糖蛋白G1、G2的表达载体，并在Vero E6细胞中呈有效表达,二者的共表达可在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上融合肽的初步确定

目的  初步确定汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上潜在的融合肽区域。  方法  采用基因定点突变技术将潜在融合肽区域的十个关键氨基酸突变成性质相左的氨基酸,转染Vero E6细胞后,间接免疫荧光（IFA）检测糖蛋白表达,采用Giemsa染色法观察细胞融合现象。  结果   在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白,IFA显示关键氨基酸突变前后细胞中均有荧光信号,呈胞浆分布,但细胞融合现象在突变后消失。  结论 潜在融合肽区域的十个氨基酸突变均对细胞融合产生明显的影响,提示该段区域很可能是病毒的融合肽。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建

目的：通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法：用Oliga6．0结合Primer Premier5．0软件设计特异性引物，通过PCR方法从广西HBsAg阳性病人血清中（血清型Adrq^＋）分离得到的病毒株构建的HBxAg质粒中扩增HBx基因。用DNA star5．01和Vector NTI Suite8．0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）质粒中。结果；成功克隆了基因型C型突变型HBx基因，并构建出真核表达载体pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明．新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的变异。结论：从广西HBsAg阳性病人病毒株（血清型Adrq^＋）中发现了新的基因型C型突变型HBx基因（mutantgenotypeC）。peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，将为进一步研究HBx基因在树鼩实验性肝癌诱发过程中所起的作用打下基础。     

汉坦病毒G1和G2糖蛋白的基因克隆及糖蛋白杆状病毒表达载体的构建

目的：克隆汉坦病毒G1和G2糖蛋白基因,构建基于杆状病毒表面展示系统（BSDS）的G1和G2糖蛋白杆状病毒表达质粒.方法：用PCR方法扩增汉坦病毒西安分离毒株84FLi株G1和G2糖蛋白基因的编码区,将其克隆入T载体,构建糖蛋白基因的T-A克隆.然后将糖蛋白编码区从T-A克隆中切下,插入杆状病毒表达转移载体pBACsurf-1的gp64信号肽和gp64成熟蛋白之间.结果：获得四个分别含有汉坦病毒G1和G2糖蛋白编码区的T-A克隆,并构建成功G1和G2糖蛋白的杆状病毒表达质粒.结论：构建成功基于BSDS的G1和G2糖蛋白杆状病毒表达质粒,为进一步用BSDS表达汉坦病毒糖蛋白奠定了基础.     

结核杆菌HSP65与汉坦病毒H8205株G2基因的构建

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，从T—H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因，经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过酶切、SDS—PAGE分别测定表达产物的相对分子量。结果 获得正向插入的pcDNA3．1／His—HSP65-G2重组表达质粒，与理论预期大小一致。结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础。     

长沙人间布鲁菌分离株omp25基因扩增和系统进化分析

目的了解长沙地区人间布鲁菌omp25基因的序列特征并阐明其系统进化关系,为布鲁菌病防控以及omp25基因克隆与表达研究提供参考。方法根据Gen Bank公布的羊种布鲁菌16M的omp25基因序列设计1对PCR引物,采用PCR法从长沙地区布鲁菌分离株基因组中扩增omp25基因,产物用凝胶电泳进行分析后进行双向核苷酸序列测定,测序结果用DNAstar 7.1进行分析,将测序结果提交Gen Bank,并利用Mega 7软件构建布鲁菌长沙分离株系统进化树。结果 41株布鲁菌成功扩增出omp25基因片段,片段长度约640 bp,通过测序后Blast同源性分析,证实41株菌株均为羊种布鲁菌,长沙分离株与10株羊种布鲁菌序列100%相同,进化树显示长沙分离的布鲁菌和国内外羊种布鲁菌位于同一进化分支上,同广西的LA1105参考株亲缘关系最近。结论长沙地区人间布鲁菌分离株omp25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁菌在同一分支,表明omp25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。     

江苏省2009—2013年汉坦病毒分离株全基因序列测定及分析

目的:从分子水平分析2009—2013年江苏省分离汉坦病毒(Hantavirus,HV)的型别及变化,为疾病的预防控制提供实验依据?方法:采集2009—2013年江苏省肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)急性期患者血清及监测点鼠肺标本?采用胶体金法检测血清样本中汉坦病毒的IgM?IgG抗体,采用免疫荧光检测鼠肺样本中汉坦病毒抗原,并用VERO E6细胞分离病毒,RT-PCR检测标本培养物中病毒M片段以鉴定HV病毒,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,MEGA6.0软件对其进行序列比对和进化分析?结果:分离到的11株病毒与陕西分离株LR1?四川分离株S85-46以及汉坦病毒原型株76-118遗传距离最为接近,属于汉滩(Hantean,HTN)型病毒?分离株与2002年分离的江苏(A9?HTN型)株以及浙江株?安徽株处于不同的进化分支上,表明遗传关系较远?结论:江苏的汉坦病毒优势株发生了变化,而且发生了宿主转换?目前疫苗仍具有保护效力,但需加强监测?     

大仓鼠携带汉坦病毒全S、部分M核苷酸序列特征分析

目的测定从仓鼠亚科宿主动物大仓鼠肺中分离到的汉坦病毒的全S、部分M基因片段的核酸序列,明确其型别。方法RT-PCR方法扩增,连接入PMD-18T载体,转化至JM109宿主菌。阳性质粒进行测序分析。结果YU62株S基因全长1701nt,有一个完整的ORF,起始位置为37 nt,终止于1326 nt,编码N蛋白429个氨基酸。与HTN-A16株核苷酸、氨基酸同源性最高分别为99.1%,99.3%。M片段克隆出1272 bp,核苷酸与HTN-SN7有85.6%的同源性。从S片段种系发生树分析来看,YU62归于HTN型H4亚型。从M片段(265-624 bp)种系发生树分析来看YU62株属于HTN的一个新亚型。结论仓鼠携带的汉坦病毒S、M片段进化不平行,YU62可能是在大仓鼠体内发生重排的HTN的新亚型。