Ad-VEGFP-CD/TK系统诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤作用.方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的SGC-7901细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药GCV和5-FC,用光镜、透射电镜观察及流式细胞术等方法观察细胞凋亡、细胞周期、细胞内DNA含量及钙离子浓度的变化.结果 腺病毒的感染率随病毒滴度的增高而递增,在感染复数为100时,前药GCV和5-FC在一定浓度搭配范围内呈剂量和时间依赖性地诱导SGC-7901细胞凋亡,电镜下可见细胞凋亡的典型改变.用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少;此外,前药还可以引起细胞内Ca2 浓度持续增加.结论 VEGF启动子可调控双自杀基因系统选择性诱导表达VEGF的SGC-7901细胞凋亡,其机制与细胞内钙离子浓度升高有关.     

VEGF介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的靶向杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对乳腺癌细胞MCF-7的体内外靶向杀伤作用。方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药GCV和5-FC,用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响及其旁观者效应;用流式细胞术观察细胞周期及细胞内DNA含量的变化。建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-VEGFP-CD/TK,腹腔注射前药GCV(50mg/kg•d)和5-FC(500mg/kg•d)14天,观察肿瘤生长抑制效应。结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,且观察到该体系对MCF-7细胞明显的旁观者效应。在感染复数为100时,用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长。结论 VEGF启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤人乳腺癌细胞MCF-7并诱导细胞凋亡,并可显著抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长。     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响

OBJECTIVE: To study the effect of adenovirus (Ad)-mediated fusion gene systemdriven by KDR promoter on the proliferation, apoptosis and cell cycle of human umbilical vein endothelial ECV304 cells. METHODS: The KDR-expressing ECV304 cells and LS174T cells not expressing KDR were both infected by the AdEasy-KDR-CDglyTK followed by treatment with the prodrugs 5-flurocytosine (5-FC) and/or ganciclovir (GCV) at different concentrations. The killing effects of the transfection on the cells were evaluated and bystander effects analyzed by coculturing the uninfected cells by AdKDR-CDglyTK with different ratios of infected cells. Flow cytometry was employed for determining the cell cycle distribution and electron microscopy performed to observe the pathological changes of cells. RESULTS: The infection rates of the resultant recombinant Ad (rAd) were similar in the cells and gradually increased with the increment in the multiplicity of infection (MOI) of the Ads. The infected cells exhibited different sensitivities to the two prodrugs: ECV304 cells infected with rAd were highly sensitive to the prodrugs, but the infected LS174T cells were not (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stronger than that of either single suicide gene (P<0.001), showing also obvious bystander effect. In addition, the cell cycle of ECV304 cells was arrested at S phase with morphologic features of apoptosis and necrosis as displayed by electron microscopy. CONCLUSIONS: CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter selectively kills the KDR-CDglyTK-expressing endothelial cells, the mechanism of which may involve cell cycle arrest and necrosis and apoptosis of the cells.     

KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人脐血管内皮细胞株ECV30的增殖活性、细胞周期及凋亡的影响.方法 以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的ECV30细胞株和对照组不表达KDR的LS17T细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对ECV30细胞的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变.结果 重组腺病毒对ECV30细胞及对照组LS17T细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均达约100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的ECV30细胞对前药的具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS17T细胞对前药不敏感(P均<0.001).融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均<0.001).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应.流式细胞术检测表明该体系抑制ECV30细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P均<0.001).同时,电镜下可见ECV30有凋亡和坏死改变.结论 KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人血管内皮细胞,其机制与细胞周期阻滞、凋亡及坏死有关.     

双自杀基因系统诱导乳腺癌细胞凋亡的体内外实验研究

目的探讨VEGF启动子驱动的双自杀基因体系对人乳腺癌细胞MCF-7靶向治疗作用以及该体系能否诱导体内外MCF-7细胞的凋亡。方法选择表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞，用重组腺病毒Ad—VEGFP—CD／TK感染之，荧光显微镜观察其感染效率。R．T—PCR．方法检测受感染细胞目的基因的表达，给予前药GCV和5-FC后于倒置显微镜观察，采用流式细胞仪检测细胞内DNA含量的变化。建立荷人乳腺癌的裸鼠动物模型，观察各治疗组的治疗效果，应用透射电镜观察移植瘤细胞超微结构。结果携带双自杀基因和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体，感染复数为100时，95％以上的受感染MCF-7和乳腺上皮细胞中有GFP表达。RT—PCK检测发现MCF-7细胞有目的基因的表达。而乳腺上皮细胞无表达。倒置显微镜下观察用药组细胞出现凋亡征象；用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中，治疗组裸鼠移植瘤的生长明显受到抑制，其余各组肿瘤生长情况无明显差别；在透射电镜下可见治疗组多量的凋亡细胞。结论体内外实验均表明VEGF启动子可调控双自杀基因体系靶向性诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

OBJECTIVE: To study the killing effect of adenovirus-mediated double suicide gene under the regulation of kinase domain-containing receptor (KDR) promoter on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). METHODS: The sequences of human KDR promoter gene, CD gene and TK gene were amplified by PCR, and the plasmid pKDR-CDglyTK was constructed. A two-step transformation protocol was employed for the construction of a recombinant adenoviral plasmid pAdKDR-CDglyTK that was transfected into 293 packaging cells to further multiply and purify the adenovirus. HUVECs were infected by the resultant recombinant adenovirus of different multiplicities of infection (MOI), and the infection rate was measured by observing the expression of green fluorescence protein (GFP). The infected cells were cultured in the culture media containing ganciclovir (GCV) and/or 5-fluorocytosine (5-FC) at different concentrations, and the killing effects were evaluated. RESULTS: Recombinant adenovirus AdKDR-CDglyTK were successfully constructed, which could efficiently infect HUVEC cells, with the infection rate associated with the MOI of the recombinant adenovirus. HUVEC cells infected with AdKDR-CDglyTK were highly sensitive to the prodrugs, their survival rate correlated to both the concentration of the prodrugs and the MOI of the recombinant adenovirus. The killing effect of the two produrgs used in combination was much stronger than that of exclusive use of GCV or 5-FC. CONCLUSIONS: Prodrug/KDR-CdglyTK system is effective in killing HUVEC cells, and its killing effect is correlated with the concentration of the prodrugs and the MOI of the recombinant adenovirus. Combination of the two prodrugs produces stronger killing effect on the cells.     

重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌细胞增值的影响

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人胃癌细胞SCG7901增值的影响.方法 重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和对照组不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对SCG7901细胞生长增值的影响.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞同未转染的各自细胞在细胞生长方面无显著性差异(P＞0.05).在前药应用下,已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感(P＜0.01).融合基因的疗效优于单一自杀基因(P＜0.01).结论 KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,抑制其增值.     

血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞

OBJECTIVE: To observe the selective killing effect of adenovirus (Ad)-mediated double suicide gene driven by kinase domain-containing receptor(KDR) promoter on human colorectal cancer LoVo cells and human umbilical vein endothelial ECV304 cells. METHODS: The plasmid pAdEasy-KDR-CDglyTK was transfected into 293 packaging cells for amplification of the infectious Ad and used to infect the KDR-producing cells (ECV304 and LoVo) and the KDR-nonproducing cells (LS174T) respectively. The three cells were treated with the prodrugs 5-flurocytosine (5-FC) and ganciclovir (GCV) at different concentrations after infection. The killing effects of the fusion gene system on the cells were evaluated. The distribution of cell cycle was detected by flow cytometry. RESULTS: The infection rates of the recombinant Ad were similar among the 3 cells, gradually increasing with the increment of multiplicity of infection (MOI) and reaching 100% with the MOI of 200. The LoVo cells and ECV304 cells infected with Ad-KDR-CDglyTK were highly sensitive to both of the prodrugs (P>0.1), whereas the infected LS174T cells failed to exhibit similar sensitivity (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stronger than that of either suicide gene (P<0.001). The cell cycle of LoVo cells was arrested at G1 phase. CONCLUSION: The CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter can selectively kill KDR-expressing human colorectal cancer LoVo cells and endothelial cells.     

血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞

目的 探讨血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动重组腺病毒CDglyTK融合基因体系对结直肠癌细胞株LOVO及人脐血管内皮细胞株ECV30的选择性杀伤作用.方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的LoVo、ECV30细胞和对照组不表达KDR的LS17T细胞,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对细胞株的杀伤效应.结果 制备的病毒滴度为2.0×1012pfu/ml.3种细胞的感染率相似,且感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均接近100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株,发现其对前药的敏感性不同:表达KDR的LoVo和ECV30细胞对前药具有较高的敏感性,且二者敏感性无显著差异(P>0.1);与前二者相比,LS17T细胞对前药不敏感(P<0.001).同时,CDglyTK双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001).流式细胞术检测表明该体系抑制LoVo细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P<0.001).结论 KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤结直肠癌LoVo细胞和血管内皮细胞.     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

大肠癌细胞的双自杀基因治疗

目的探讨腺病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的杀伤作用及其放射增敏作用。方法用重组的腺病毒载体感染大肠癌细胞株SW480,用RT-PCR方法检测CD(cytosine deaminase)-TK(thymidine kinase)融合基因的表达,单独或联合给予前体药物GCV和5-FC后,用MTT法测定双自杀基因对大肠癌细胞的体外杀伤效应,用克隆形成实验分析感染有自杀基因的大肠癌细胞的放射增敏作用。结果感染有自杀基因的大肠癌细胞,在给予前体药物后,细胞的存活率明显下降,联合给予GCV和5-FC细胞的存活率较单独给GCV或5-FC存活率明显降低(χ2=30.371,P<0.01);联合使用5-FC和GCV时,CD-TK自杀基因的旁观者效应最明显(P<0.01);使用GCV和(或)5-FC能增加感染有自杀基因的大肠癌细胞对照射的敏感性,在联合使用前体药物时更为明显(P<0.01)。结论CD-TK双自杀基因体系对大肠癌细胞具有显著的杀伤作用和放射增敏作用,证明双自杀基因系统具有临床应用价值。     

Adenovirus-mediated CDglyTK fusion gene system driven by KDR promoter selectively kills MCF-7 breast cancer cells and vascular endothelial cells]

OBJECTIVE: To observe the selective killing of MCF-7 human breast cancer cells and vascular endothelial ECV304 cells by adenovirus (Ad)-mediated double suicide gene driven by KDR promoter. METHODS: The plasmid pAdEasy-KDR- CDglyTK was transfected into 293 packaging cells for amplification of the infectious Ad, which were then used to infect KDR-producing ECV304 and MCF-7 cells and LS174T cells that did not produce KDR. The infected cells were treated with 5-FC and/or GCV at different doses to observe the cell-killing and bystander effects of AdKDR-CdglyTK. The cell cycle changes were also detected by flow cytometry. RESULTS: The Ad at the titer of 2.0 x 10(12) pfu/ml was obtained after the amplification, whose infection rates of the cells were similar, but could be increased gradually with the multiplicity of infection (MOI) till reaching 100% with the MOI of 200. The infected cells exhibited different sensitivities to the two prodrugs: ECV304 cells and MCF-7 cells infected with Ad-KDR-CDglyTK showed similar high sensitivity to the prodrugs (P=1.00), whereas the infected LS174T cells appeared to be less sensitive (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stranger than that of either suicide gene (P<0.001), but all exhbiting considerable bystander effect. In addition, the cell cycle of MCF-7 cells was arrested at G1 phase. CONCLUSIONS: CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter can selectively kill KDR-expressing vascular endothelial cells and MCF-7 cells.     

AdKDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌MGC-803细胞体的外杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子第二受体,亦即酪氨酸激酶受体(kinase domain-containing receptor,KDR) 启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人胃癌细胞株MGC-803的杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK 在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MGC-803细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和／或更昔洛韦,观察该体系对MGC-803细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果所得病毒滴度为2．0×1012pfu／ml。MGC-803细胞株感染率随腺病毒滴度的递增而增加。融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0．001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MGC-803细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0．001)。同时,电镜下可见MGC-803细胞有凋亡和坏死改变。结论腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因体系可以有效地杀伤人胃癌细胞。     

融合自杀基因对骨肉瘤细胞作用的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶/胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因（HSV TK/CD）对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法将含TK/CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MG 63细胞,测定感染效率后,分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒,计算瘤细胞增殖抑制率,MTT法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest 33342 染色法分析杀伤机制。结果含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG 63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因和双基因相加的作用 (P＜0.05);其杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡。结论融合自杀基因HSV TK/CD对骨肉瘤细胞系MG 63细胞的生长有明显的抑制作用。     

慢病毒介导的双自杀基因对胃癌细胞的杀伤作用

目的探讨慢病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对胃癌细胞SGC-7901的杀伤作用。方法用重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK体外感染胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜观察其感染效率,Giemsa染色法观察转基因的胃癌细胞形态学变化;用流式细胞术观察细胞周期的变化。RT-PCR法检测受感染细胞CD/TK基因的表达。然后加用前药更昔洛韦(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC)用MTT法检测该体系对胃癌细胞的杀伤作用。结果慢病毒的感染率随病毒滴度的增高而递增。Giemsa染色法显示慢病毒载体对体外培养的胃癌细胞形态无明显影响。流式细胞仪检测慢病毒感染胃癌细胞前后,处于G0-G1,G2-M,S期的细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。经RT-PCR检测发现转基因细胞有目的基因的表达。MTT法检测显示前药GCV和5-FC在一定浓度搭配范围内呈剂量依赖性地抑制SGC-7901细胞增殖,未转染慢病毒的细胞对前药不敏感;联合两种前药对SGC-7901的疗效优于任一单用前药(P<0.05)。联合用药[(0.1+40)、(1+80)、(10+160)、(100+320)]mg/L具有协同作...     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK 基因靶向杀伤胃癌细胞的体外实验研究

目的探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的双自杀基因体系对人胃癌细胞SCG7901靶向杀伤作用以及是否存在旁观者效应。方法用MOI=100时,将携带融合基因重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK及Ad-CMV-CDglyTK体外感染SCG7901、ECV304和HepG2细胞,检测细胞的感染效率以及转基因肿瘤细胞在mRNA水平上融合基因的表达;在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦分别按不同浓度、不同作用时间和方式下,观察双自杀基因体系对SCG7901细胞的靶向杀伤作用和旁观者效应。结果携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901、HepG2和ECV304细胞中有GFP表达。感染腺病毒Ad-CMV-CDglyTK的各细胞以及感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞对单一前药具有较高的敏感性,细胞的存活率各随单一前药浓度的增加而递减;而感染腺病毒的Ad-KDR-CDglyTK的HepG2细胞对前药不敏感。感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞分别在同一浓度前药的作用下,...     

pAdKDR/CD/TK自杀基因系统对大肠癌SW480细胞体外杀伤作用的实验研究

目的研究腺病毒介导的KDR/CD/TK双自杀基因系统对大肠癌SW480细胞的杀伤作用。方法构建pAdKDR/CD/TK重组腺病毒,采用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒感染大肠癌SW480细胞、ECV304细胞及LS174T细胞,再加入不同浓度前药（GCV、5-FC）培养后,以MTT法检测细胞生长抑制率,观察重组腺病毒联合GCV和5-FC对大肠癌SW480细胞、ECV304细胞和LS174T细胞的杀伤作用,了解前药GCV、5-FC、GCV/5-FC对3种细胞的杀伤作用及KDR启动子的靶向杀伤作用。结果 pAdKDR/CD/TK重组腺病毒对3种细胞具有相似的感染率,感染腺病毒的3种细胞中除LS174T细胞外,均检测到目的基因的表达。当转基因细胞的比率为50%时,SW480和ECV304细胞分别有（31.3±5.64）%、（33.5±5.4）%的存活,而LS174T细胞存活率仍为（98.1±0.95）%（P均〈0.01）。单用GCV浓度为80μg/ml时,SW480细胞、ECV304细胞、LS174T细胞的生存率分别为（45.6±6.5）%、（45.9±5.4）%、（99.5±4.7）%,单用5-FC浓度为1000μg/ml时,三者生存率分别为（40.4±5.8）%、（45.3±4.7）%、（97.0±6.2）%,联合用药（80μg/ml＋1000μg/ml）时,三者生存率分别为（20.5±0.46）%、（25.6±1.33）%、（97.3±3.96）%。联合用药分别与GCV及5-FC单独用药生存率比较,差异均有统计学意义（P均〈0.05）。提示单独应用GCV及5-FC对SW480细胞、ECV304细胞有较强的杀伤作用,联合用药效果更佳。结论含KDR启动子的融合基因,具有选择性杀伤作用。前药GCV、5-FC对转染融合基因的大肠癌SW480细胞具有体外抑制作用,且有较强的旁观者效应。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。