硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后神经元修复的影响

目的探讨硫酸软骨素酶ABC（ChABC）对脊髓损伤后神经元修复的影响。方法SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组、生理盐水对照组和ChABC治疗组,采用Allen法打击大鼠胸10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天1次连续1周蛛网膜下注射生理盐水和ChABC。在伤后第1天,第1、2、4周应用免疫组化检测各组组织切片中NF200的变化,尼氏染色观测各组脊髓切片中尼氏体和神经元的改变,BBB评分检测损伤的后肢运动恢复情况。结果大鼠脊髓损伤后1d和1周给药组NF200着色面积、Nissl染色阳性细胞和BBB评分与生理盐水组比较差异无统计学意义。在2、4周,治疗组要显著优于生理盐水组（P〈0.05）。结论ChABC能促进大鼠脊髓损伤后神经元的修复,提高后肢运动功能的恢复。     

神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后Caspase-3和c-fos表达的影响

目的研究神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后Caspase-3和c-fos表达的影响。方法 SD大鼠45只,随机分成3组(n=15):假手术组、脊髓损伤模型组(模型组)和神经干细胞移植组。假手术组仅打开锥板但不离断脊髓;模型组动物锥板打开后横向断开脊髓,止血并逐层缝合;神经干细胞移植组椎板打开后横向断开脊髓,止血并注入神经干细胞悬液,再逐层缝合。手术后1、2、3和14 d对大鼠进行神经功能评分(BBB评分)。14 d后处死动物,取脊髓组织,部分用于制备切片并进行TUNEL标记,检测神经细胞(神经元)的凋亡;对另一部分脊髓组织进行蛋白提取,Western blotting检测Caspase-3和c-fos蛋白的表达。结果与假手术组相比,模型组和神经干细胞移植组BBB评分均显著下降(P<0.05);但神经干细胞移植组神经功能改善情况好于模型组(P<0.05)。模型组和神经干细胞移植组的细胞凋亡率均显著高于假手术组(P<0.05);神经干细胞移植组细胞凋亡率明显低于模型组(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,模型组和神经干细胞移植组大鼠脊髓组织中Caspase-3和c-fos的表达量显著高于假手术组(P<0.05);神经干细胞移植组大鼠脊髓组织中Caspase-3和c-fos的表达量显著低于模型组(P<0.05)。结论在大鼠脊髓损伤后,神经干细胞移植能够加快大鼠损伤后的恢复并降低细胞凋亡率,使Caspase-3和c-fos的表达量减少,对大鼠脊髓损伤具有治疗作用。     

补阳还五汤及其四类有效部位对脊髓损伤大鼠大脑运动皮质的神经保护作用

目的：观察补阳还五汤（BYHWD）及其四类有效部位（生物碱、苷、多糖、苷元）对脊髓损伤（SCI）大鼠大脑运动皮质神经元的影响,探究其神经保护作用的可能机制。方法 SD 雄性大鼠48只,随机分为8组：正常组、假手术组、SCI 组、BYHWD组、生物碱组、苷组、多糖组、苷元组。通过在T3-T4之间横断右侧半脊髓制备SCI模型,分别于术前1 d及术后1 d、1 w、4 w、8 w运用BBB评分评定大鼠后肢运动功能;术后8 w用TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果 SCI组与药物干预各组BBB评分均明显低于同期正常组、假手术组（P＜0.01）;术后4 w,BYHWD 组和生物碱组大鼠的BBB 评分高于SCI组（P＜0.05）;术后8w,BYHWD组、生物碱组和苷组大鼠的BBB评分高于SCI组（P＜0.05）。术后8 w, SCI组及药物干预各组大鼠细胞凋亡率明显高于正常组和假手术组（P＜0.01）。BYHWD组、生物碱组和苷组大鼠的细胞凋亡率低于SCI组（P＜0.01或P＜0.05）;生物碱组、苷组、多糖组、苷元组的细胞凋亡率高于BYHWD组（P＜0.01或P＜0.05）。结论 BYHWD具有改善SCI大鼠后肢运动作用,其有效部位中的生物碱、苷可能为起效的主要物质基础,该作用机制可能与拮抗SCI大鼠运动皮质神经元凋亡有关。     

BDNF联合chABC鞘内注射对大鼠脊髓损伤修复的影响

目的 探究脑源性神经营养因子（BDNF）联合软骨素酶（chABC）鞘内注射对大鼠脊髓损伤后运动感觉功能的影响以及脊髓组织中神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的影响。方法 将SD大鼠分为假手术对照组（A组）,损伤对照组（B组）,chABC治疗组（C组）,BDNF治疗组（D组）,联合治疗组（E组）,采用后肢运动功能评分法（CBS）对大鼠术后1周、2周、4周和2个月后肢运动功能进行评定,苏木精-伊红（HE）染色法观察不同时间点大鼠脊髓组织变化,免疫组化法观察各组大鼠脊髓组织神经干细胞的影响,荧光免疫组化法观察各组大鼠神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的变化。结果 术前各组大鼠神经功能均正常,术后1~2周,B、C、D、E各组CBS评分降低,但各组间对比差异无统计学意义（P>0.05）;术后4周~2个月,C、D、E组CBS评分逐渐降低,低于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。与A组相比,B组不同时间点BrdU阳性细胞数目降低,差异有统计学意义（P<0.05）。脊髓损伤后1周,C、D、E组大鼠脊髓组织BrdU阳性细胞数目与B组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;脊髓损伤后第2~4周,C、D、E组BrdU阳性细胞数高于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。与空白对照A组比较,B组脊髓损伤后不同时间点Nestin阳性细胞数目均减少,差异有统计学意义（P<0.05）。脊髓损伤后2周、4周、2个月,C、D、E组脊髓组织Nestin阳性细胞数高于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。脊髓损伤后1周,A组星形胶质细胞比例逐渐降低,神经元细胞比例逐渐升高。B组细胞3种细胞比例均较低,随着时间延长,神经元细胞比例缓慢升高,星形胶质细胞比例缓慢下降。C、D、E组脊髓受损后脊髓受损后4周~2个月,C、D、E组神经元比例逐渐升高,星形胶质细胞逐渐下降,与B组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 BDNF、chABC鞘内注射后对大鼠脊髓损伤后运动、感觉功能恢复具有一定的促进作用,可能与促进神经干细胞增殖以及神经元细胞的分化有关,但两者联合后效果并不显著。     

淫羊藿苷可减轻大鼠脊髓损伤后的脂质过氧化

目的研究淫羊藿苷对大鼠脊髓损伤后脂质过氧化的影响。方法72只健康成年清洁级雄性SD大鼠按随机数字表法分为 淫羊藿苷组、对照组及假手术组3组,每组24只。对照组和淫羊藿苷组采用改良Allen法制作脊髓损伤模型,假手术组仅切开椎 板不损伤脊髓。术后即刻淫羊藿苷组给予淫羊藿苷（100 mg/kg）灌胃,对照组和假手术组给予等量生理盐水灌胃,1次/d。术后 24 h采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性;采用干湿重法检测脊髓 组织的含水量;术后48 h 采用透射电镜观察脊髓组织超微结构,并采用Kaptanoglu 评分法进行超微结构评分;术后7、14、21、 28 d采用BBB评分法评定大鼠运动功能。结果术后24 h对照组和淫羊藿苷组MDA含量显著高于假手术组,淫羊藿苷组低于 对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;对照组和淫羊藿苷组SOD活性显著低于假手术组,淫羊藿苷组高于对照组,差异有统计学 意义（P<0.05）。术后48 h,对照组和淫羊藿苷组脊髓组织含水量、超微结构评分均显著高于假手术组,淫羊藿苷组均显著低于 对照组（P<0.05）。术后各时间点对照组和淫羊藿苷组大鼠BBB评分均低于假手术组,差异有统计学意义（P<0.05）;淫羊藿苷组 大鼠BBB评分高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论淫羊藿苷能够明显降低脊髓损伤后的MDA含量,升高SOD的 活性,减轻脂质过氧化、脊髓水肿和脊髓的组织病理学损伤,改善脊髓损伤大鼠的运动功能,有效地保护脊髓组织和神经作用。     

褪黑素对急性脊髓损伤大鼠血清及脊髓内神经生长因子表达的影响

目的研究褪黑素（MT）对脊髓损伤大鼠血清及脊髓内神经生长因子（NGF）表达水平的影响。方法84只健康成年雄性SD大鼠随机分为模型对照组（n=36）、模型MT组（n=36）及假手术组（n=12）。建立脊髓损伤模型后,模型对照组给予无水乙醇,模型MT组给予MT,均为腹腔注射。对比术后12h、3、5d大鼠血清及脊髓组织中NGF的表达及Tarlov评分。结果术后12h模型对照组及模型MT组Tarlov评分显著低于假手术组（P〈0．05）。模型MT组TarlOV评分稍高于模型对照组,但差异无统计学意义（P〉0．05）。术后3、5d模型MT组Tarlov评分均显著高于模型对照组（P〈0．05或P〈0．01）。术后12h、3、5d模型对照组和模型MT组血清NGF水平、脊髓组织NGF蛋白及NGFmRNA水平均较假手术组显著上升,模型MT组则显著高于模型对照组（P〈0．05或P〈0．01）。结论MT通过调高脊髓损伤大鼠体内NGF的表达起到减轻神经细胞损伤、促进神经细胞再生和神经功能恢复作用。     

大鼠损伤脊髓BDNF的表达变化

目的探讨大鼠脊髓横断损伤尾端脑源性神经营养因子(BDNF)基因表达变化及其与神经行为学改变的关系。方法成年SD大鼠66只,随机分为假手术组和脊髓全横断(SCT)术后1d、3d、7d、14d、21d、28d组,其中假手术组和SCT术后28d组13只,其余每组8只。假手术组和SCT术后28d组各取5只大鼠于0、7、14、21、28d进行神经功能评分(BBB评分)后,于28d处死大鼠,取脊髓尾端组织进行原位杂交和免疫组化染色及ELISA分析,观察BDNF mRNA和蛋白在脊髓尾端的表达和分布;剩余每组各时间点取8只大鼠脊髓尾端组织用于RT-PCR检测BDNFmRNA含量变化。结果 SCT后大鼠后肢运动功能消失,BBB评分于术后14d至28d增加较前一时间点明显(P<0.05);原位杂交及免疫组化示BDNF mRNA及其免疫产物定位于神经元胞浆和突起;RT-PCR示SCT术后各时点BDNF mRNA表达与假手术组比较无差异(P>0.05),而SCT术后14d时BDNFmRNA水平高于术后1d和3d(P<0.05);ELISA检测发现损伤脊髓28dBDNF含量高于假手术组(P<0.05)。结论 SCT后大鼠后肢运动功能随时间呈现一定可塑性,其机制可能与BDNF表达增加相关。     

锌对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响

目的探讨进食不同浓度锌对脊髓损伤（spinalcordinjury,SCI）大鼠BDNF表达的影响。方法取60只雄性sD大鼠,建立Allen＇s SCI模型,随机分成假手术组、模型组、低锌喂养组和高锌喂养组。HE染色检测各组大鼠脊髓损伤情况,实时定量PCR检测各组大鼠脊髓中BDNF表达的变化,BBB评分检测后肢运动功能的改善情况。结果高锌喂养组BDNF表达量在每个时间点均明显高于其他3组,组问差异有显著性意义（P〈0．01）。术后1W脊髓HE染色显示高锌喂养组脊髓损伤减轻;术后各时间点,高锌喂养组大鼠BBB评分明显高于模型组和低锌喂养组。结论进食合适浓度锌可促进SCI大鼠BDNF的高表达,并明显改善大鼠后肢运动功能。     

骨髓单个核细胞移植对脊髓半横断大鼠损伤组织中髓鞘碱性蛋白表达的影响

目的：研究骨髓单个细胞移植脊髓半横断大鼠脊髓损伤区域后髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）表达的影响.方法：取Wistar大鼠胫骨及股骨提取骨髓单个核细胞,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,制成细胞悬液.建立大鼠脊髓右半横断模型,造模后分为假手术组、模型组、骨髓单个核细胞移植组.于模型建立成功后7d,14d,21d,28d手术的大鼠进行BBB评分从而评估损伤脊髓神经功能恢复情况,利用RT-PCR观察MBP mRNA的表达变化.结果：术后各时间点假手术组BBB评分均明显高于骨髓单个核细胞移植组、模型组（P＜0.05）;术后随时间延长骨髓单个核细胞移植组、模型组BBB评分逐渐增加,14、21、28d时骨髓单个核细胞移植组BBB评分明显优于模型组（P＜0.05）.PT-PCR测试各时间点骨髓单个核细胞移植组和模型组大鼠脊髓中MBP mRNA的表达量高于假手术组,且骨髓单个核细胞移植组高于模型组（P＜0.05）.结论：骨髓单个细胞移植可提高脊髓组织中MBP的表达,有助于大鼠半横断脊髓损伤神经功能的恢复.     

金腰带联合甲基强的松龙对脊髓损伤大鼠行为学及脑源性神经营养因子表达的影响

目的探讨金腰带和甲基强的松龙联合应用对脊髓损伤（SCI）大鼠的疗效及其对脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影
响,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。方法将雌性SD大鼠30只随机分为：（1）假手术组;（2）脊髓挫伤组;（3）甲基强的松龙
治疗组（术后8 h内肌注50 mg/kg,此后每天甲基强的松龙肌注量减少10 mg/kg）;（4）金腰带治疗组（50 mg/kg,每日1次灌胃）;
（5）金腰带和甲基强的松龙联合治疗组（两种药物及给药方法相加）。采用BBB评分系统对后肢运动功能进行评分。对大鼠脊髓损伤
术后4周的脊髓切片进行BDNF免疫组化染色,观察阳性细胞定位、分布以及数量变化。用方差分析进行多个样本间比较。结
果BDNF免疫反应阳性产物主要分布于脊髓灰质腹角和背角神经元。联合治疗组BDNF阳性神经元数量以及BBB评分分值
较假手术组、脊髓挫伤组、甲基强的松龙治疗组和金腰带治疗组均显著增高, 差异有统计学意义（P<0.05）。结论甲基强的松龙
和金腰带联合治疗脊髓损伤的疗效优于单纯甲基强的松龙治疗组和金腰带治疗组,其发挥疗效可能与上调BDNF表达有关。
     

大黄对大鼠脊髓损伤后血-脊髓屏障的保护作用

目的 观察不同浓度大黄对大鼠脊髓损伤(SCI)后血-脊髓屏障(BSCB)的影响,筛选大黄煎药灌服的最佳浓度,拟为临床治疗SCI提供一定的依据.方法 成年健康SD大鼠125只,随机分为假手术组(Sham组)、模型组及大黄低、中、高剂量组.大黄各剂量组用大黄水溶液灌胃,其余两组用等量生理盐水.记录大鼠SCI后双后肢运动功能(BBB)评分、脊髓含水量以及荧光显微镜观察注入伊文思蓝(EB)后的BSCB情况.结果 (1)BBB评分:模型组和大黄低、中、高剂量组与Sham组比较差异均有统计学意义(P<0.05).(2)脊髓含水量的测定:模型组和大黄低、中、高剂量组与Sham组比较差异均有统计学意义(P<0.05).(3)荧光显微镜下观察到Sham组没有EB染出,模型组EB大量染出,以3 d时染出最多,大黄各剂量组EB染出较模型组有不同程度减少,以大黄中剂量组EB染出最少.结论 中剂量组大黄有效地降低了大鼠SCI后BSCB的通透性,对其保护作用最为明显.     

缺血后处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用及对钙敏感受体和Caspase-12表达的影响

目的: 探究缺血后处理(ischemic post conditioning,IPC)对大鼠脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury,SCIRI)的保护作用及其对钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)及内质网应激相关蛋白Caspase-12表达的影响。方法: 将50只SD大鼠随机平均分为5组：假手术组,缺血再灌注模型组（IR组）,IR模型+IPC组（IPC组）,IR模型+IPC+激动剂组（IPC GdCl3组）和IR模型+抑制剂组（NPS2390组）。假手术组仅显露大鼠腹主动脉而不用动脉夹夹闭,其他各组夹闭腹主动脉25 min后再开放建立SCIRI模型;IPC组再灌注3 min后予3个循环的IPC;IPC-GdCl3组在连续2天每天1次尾静脉注射CaSR激动剂GdCl3后行IPC组操作;NPS2390组提前2天每天1次通过尾静脉注射NPS2390,随后建立IR模型。采用BBB评分法对大鼠后肢运动功能进行评价,采用TUNEL染色检测脊髓组织中神经细胞凋亡数目,采用蛋白质印迹及免疫组织化学定量检测脊髓组织中CaSR及Caspase-12表达。结果： 各模型组大鼠BBB评分均明显低于假手术组（P<0.05）;IPC组、NPS2390组BBB评分均明显高于IR组（P<0.05）;IPC组BBB评分明显高于IPC GdCl3组（P<0.05）。TUNEL染色结果显示,假手术组凋亡细胞极少;IR组较IPC组和NPS2390组凋亡神经细胞数量均明显增多（P<0.05）;IPC组较IPC-GdCl3组凋亡神经细胞数量明显减少（P<0.05）。蛋白质印迹结果表明,建模各组较假手术组CaSR及Caspase-12蛋白表达量明显升高（P<0.05）;IR组CaSR与Caspase-12表达量均明显高于IPC组和NPS2390组（P<0.05）;IPC组较IPC GdCl3组CaSR与Caspase-12表达量明显减少（P<0.05）。免疫组织化学各组比较情况与蛋白质印迹一致。结论： IPC对大鼠SCIRI起到保护作用,且可能与抑制脊髓组织中CaSR及Caspase 12的表达有关。     

刺五加皂苷对急性脊髓损伤后脊髓内BDNF和NGF表达的影响

［摘要］ 目的 研究刺五加皂苷对脊髓损伤后组织内脑源性神经营养因子（BDNF）和脊髓内神经生长因子（NGF）两种蛋白表达的影响,探讨刺五加皂苷对脊髓损伤后的保护作用。方法 将45只雄性大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和刺五加皂苷干预组,每组15只。将实验动物用10%水合氯醛麻醉后运用改良Allen’s法进行急性脊髓损伤模型造模。造模后假手术组予正常饲养,模型组造模后进行连续7 d生理盐水腹腔注射,刺五加皂苷干预组造模后进行连续7天相应剂量的刺五加皂苷持续腹腔注射。ELISA法检测血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）,通过病理切片分析大鼠脊髓组织病理变化,蛋白印迹法检测大鼠脊髓内BDNF和NGF表达。结果 与假手术组比较,模型组和刺五加皂苷干预组大鼠血清中MDA的含量增加（P﹤0.05）,SOD的含量降低（P﹤0.05）,脊髓有明显损伤,大鼠脊髓组织中的BDNF和NGF蛋白表达量上升（P﹤0.05）;与模型组相比,刺五加皂苷组大鼠后肢功能具有明显改善,血清中中MDA含量降低（P﹤0.05）,SOD的含量升高（P﹤0.05）,大鼠脊髓组织中的BDNF和NGF蛋白表达量上升（P﹤0.05）。结论 刺五加皂苷促进脊髓组织中神经元细胞内BDNF和NGF表达,利于损伤神经元的修复,对大鼠急性脊髓损伤具有保护作用。     

褪黑素对脊髓损伤早期大鼠神经生长因子表达的影响

目的:通过观察褪黑素(MT)对脊髓损伤(SCI)早期大鼠体内神经生长因子(NGF)表达的影响,探讨MT治疗SCI的机制。方法:60只成年SD大鼠随机分为3组:模型组、MT组和假手术组,每组20只。前2组以改良的Allen’sWD法建立脊髓T12水平损伤模型,假手术组仅行椎板切除不损伤脊髓。MT组于术后10min腹腔注射MT100mg/kg,模型组则腹腔注射等体积无水乙醇。术后12h对3组大鼠进行BBB运动功能评分后处死,取血液检测NGF水平;取脊髓标本进行病理观察,RT-PCR法检测NGFmRNA,免疫组化SP法检测NGF蛋白。结果:模型组和MT组大鼠于术后均出现了严重的下肢神经功能障碍,2组的BBB运动功能评分差异无统计学意义(P>0.05)。MT组脊髓组织病理变化较模型组减轻。3组大鼠脊髓内NGFmRNA、NGF蛋白表达水平和血清NGF水平差异均有统计学意义(F=336.819,321.762和122.707,P均<0.001),3者均在MT组中最高,SCI组次之,假手术组最低(P<0.01)。结论:MT可通过提高SCI大鼠体内NGF的表达减轻SCI。     

结扎腰动脉建立大鼠脊髓缺血模型有效性的评估

目的 结扎腰动脉建立大鼠脊髓缺血模型,为研究缺血性脊髓病、继发性脊髓损伤的发生机制提供良好的载体.方法 将大鼠随机分为假手术组(仅分离出腰动脉)和脊髓缺血组(结扎所有腰动脉),于术后进行大鼠后肢运动功能BBB评分、脊髓苏木精-伊红(H-E)染色镜下观察及Caspase-3免疫组织化学检测.结果 术后48 h对缺血组大鼠后肢运动功能BBB评分为(9.22±0.97),与对照组比较,差别有统计学意义(P<0.01);H-E染色镜下可见脊髓缺血组大鼠正常神经元数目明显减少;免疫组织化学显示Caspase-3阳性细胞呈棕黄色,脊髓缺血组阳性率远大于假手术组,差别有统计学意义(P<0.01).结论 通过结扎大鼠腰动脉可以建立稳定的脊髓缺血模型,为脊髓缺血后损伤机制和预防措施的研究提供良好的载体.     

胸主动脉阻断联合主动脉旁路循环技术建立大鼠脊髓缺血损伤模型

目的 改良大鼠脊髓缺血损伤动物模型.方法 大鼠分为3组:实验组,阻断胸主动脉(T4-T11)+主动脉旁路循环(胸主动脉起始部-胸主动脉近膈肌部),阻断20 min;对照组,阻断胸主动脉(T4) 20 min;假手术组,只开胸不阻断胸主动脉.术中采用经颅运动诱发电位(Tc-MEP)监测脊髓功能,术后7d观察脊髓切片病理改...     

番茄红素通过上调Beclin1-Atg 5通路激活自噬发挥对脊髓损伤大鼠的神经保护作用

目的 探讨番茄红素对大鼠脊髓损伤后的神经保护机制。方法 27只（6~8周龄）雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和实验组各9只。大鼠麻醉清醒后,实验组20 mg/kg番茄红素玉米油溶液灌胃,假手术组和模型组等体积玉米油灌胃,每天1次,共14 d。分别于术后1、3、7、14 d,采用斜板试验评估各组大鼠后肢运动功能变化;术后7 d,采用qRT-PCR和Western blot检测大鼠脊髓组织自噬相关因子Beclin1、Atg 5的表达水平。结果 斜板试验结果显示,术后1、3、7、14 d模型组和实验组大鼠后肢运动功能低于假手术组（P<0.05）;术后7、14 d,实验组较模型组大鼠后肢运动功能提高,差异有统计学意义（P<0.05）;实时荧光定量PCR（quantitative real-time,qRT-PCR）和蛋白质印迹法（western blot）结果显示,术后7 d模型组和实验组Beclin1、Atg 5的mRNA和蛋白质表达均较假手术组升高,实验组与模型组比较显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 番茄红素可能通过上调Beclin1-Atg 5通路激活自噬发挥对脊髓损伤大鼠的神经保护作用。