免疫原性HER2突变体蛋白对小鼠T细胞亚群分化的影响

为了考察蛋白质中定点引入对硝基苯丙氨酸后对T细胞分化的影响,以人表皮生长因子受体2(HER2)胞外区为模型分子,利用实验室前期构建的工程菌表达了定点引入对硝基苯丙氨酸的HER2突变体。用含对硝基苯丙氨酸的HER2突变体免疫小鼠,分析其对小鼠T细胞亚群分化的影响。研究结果显示,对硝基苯丙氨酸的引入显著增强了HER2的免疫原性,免疫5周后,突变体免疫组的小鼠体内抗HER2抗体滴度明显高于PBS组和原型免疫组的小鼠;流式细胞术检测结果显示,小鼠淋巴结内Tfh细胞比例从4%上升至8%,而Treg细胞比例从5%下降至1%;QT-PCR分析结果显示,Tfh细胞关键转录因子Bcl-6的mRNA水平提高了2倍,而Treg细胞关键转录因子FOXP3的mRNA水平明显降低;ELISA法检测血清中Tfh细胞效应因子IL-21的含量从4 pg/mL上升至28 pg/mL。上述研究结果证实,含有对硝基苯丙氨酸的HER2突变体可以通过激活Tfh细胞分化而引起高效免疫应答。     

硝基化通用T细胞表位疫苗CD47-NitraTh的设计与抑瘤活性

利用遗传密码扩充技术,将免疫原性氨基酸对硝基苯丙氨酸定点引入到通用T细胞表位,并将其与免疫检查点分子CD47分子胞外区19-140片段融合表达,构建了靶向免疫检查点CD47的疫苗CD47-NitraTh。CD47-NitraTh能够在BALB/c小鼠体内诱导产生高滴度抗体,并可显著抑制CT26结肠癌肿瘤生长,提高脾脏CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的比例,同时可促进naïve T细胞向Th1细胞极化。值得关注的是,CD47-NitraTh不仅提高了肿瘤浸润淋巴细胞的比例,同时还降低了肿瘤组织中Treg细胞比例,意味着CD47-NitraTh疫苗能够重塑肿瘤免疫抑制性微环境。本研究结果提示,CD47-NitraTh 可以作为有效的肿瘤疫苗候选分子。     

含对硝基苯丙氨酸HER2疫苗的免疫原性研究

为了打破HER2自身蛋白的免疫耐受,产生高效的免疫应答,利用遗传密码扩充技术,将免疫原性氨基酸对硝基苯丙氨酸定点引入到HER2片段的第5、26、79位,获得了含有对硝基苯丙氨酸的HER2突变体。通过镍亲和色谱柱,获得纯度达95%以上的原型和突变体HER2分子。对HER2疫苗的免疫原性进行分析,结果显示,pNO₂Phe⁷⁹HER2能够在C57BL/6小鼠体内产生高滴度的交叉性抗体。免疫小鼠的抗血清能够识别具有完整HER2受体胞外区的SKBR-3细胞,并通过ADCC效应裂解HER2高表达的HER2+B16F10细胞。这些研究结果提示,定点引入了对硝基苯丙氨酸的pNO₂Phe⁷⁹HER2可以作为靶向HER2的肿瘤疫苗候选分子。     

PDCD4基因对T淋巴细胞亚群分化的影响

目的探讨PDCD4基因对小鼠T淋巴细胞亚群分化的影响。方法采用流式细胞术检测PDCD4基因缺失小鼠脾细胞和淋巴结细胞中的CD8+T和CD4+T,及其亚群Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)的特异性标记分子,并分析各细胞亚群的比例变化。结果 pdcd4-/-小鼠脾脏和淋巴结中CD8+T细胞数量较野生型C57BL/6小鼠有所下降(P<0.05),CD4+T细胞及Th1细胞也呈下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05);而PDCD4基因缺失后Th2和Th17的分化比例无显著变化(P>0.05);进一步分析CD4+T细胞群体中CD25+Foxp3+Treg的表达,发现pdcd4-/-小鼠CD25+Foxp3+Treg比例明显上调(P<0.05)。结论 PDCD4基因能够影响部分T淋巴细胞亚群的分化,PDCD4基因敲除小鼠中CD8+T细胞数量下降和CD25+Foxp3+Treg比例升高,提示PDCD4基因有可能在免疫调节方面起到一定作用。而PDCD4基因对于CD4+T以及Th1、Th2和Th17的分化并无明显作用。     

免疫检查点B7-H3表位疫苗的设计及其抗肿瘤活性

B7-H3是在多种肿瘤表面过表达的免疫检查点分子,是肿瘤免疫治疗的理想靶点。利用本实验室前期设计的硝基化T细胞表位为基础,构建了可靶向免疫检查点B7-H3的表位疫苗。该疫苗能在CT26结肠癌模型中显著抑制肿瘤生长,且与PD-L1蛋白疫苗有明显的协同作用。B7-H3疫苗可以增加脾脏T淋巴细胞中CD4⁺ T细胞的比例和肿瘤浸润T淋巴细胞中CD8⁺ T细胞的比例,同时减少肿瘤浸润CD4⁺ T淋巴细胞中抑制性Treg细胞的比例,有效改善肿瘤免疫抑制微环境。研究结果提示,B7-H3表位疫苗可以作为有效的肿瘤疫苗候选分子。     

养阴活血方对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠Treg/Th17失衡及动脉粥样硬化的影响

探讨养阴活血方(YHF)对高脂饮食诱导的ApoE^-/-小鼠Treg/Th17失衡及动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的影响。小鼠给予高脂饮食诱导AS,YHF低剂量(18 g/kg,以生药计)、YHF高剂量(36 g/kg,以生药计)灌胃给药20周进行干预。油红O脂肪染色法观测主动脉斑块面积变化;生化分析血脂水平;流式细胞术检测外周血Treg、Th17比例;荧光实时定量PCR(qRT-PCR)、免疫组化(IHC)及Western blot检测主动脉Foxp3、RORγt mRNA及蛋白表达。分离小鼠脾脏CD4⁺T细胞并用anti-CD3/CD28活化,再经LPS刺激和YHF干预后,qRT-PCR与免疫荧光(IF)检测CD4⁺T细胞Foxp3、RORγt表达。结果显示,YHF显著减小主动脉斑块面积,降低血脂水平,增加Treg/Th17比值;上调主动脉Foxp3表达而下调RORγt表达;且在体外上调CD4⁺T细胞Foxp3表达而下调RORγt表达。本研究表明,YHF可以调节高脂饮食诱导的ApoE^-/-小鼠Treg/Th17比例失衡,减弱LPS对CD4⁺T细胞的炎性刺激影响,从而改善AS。     

哮喘小鼠CD4+CD25+调节性T细胞数量及功能的改变

目的观察哮喘小鼠脾脏CD^4＋CD2^4＋5’调节性T细胞（简称Treg细胞）数量及功能的改变。方法以屋尘螨提取液复制小鼠哮喘模型后，分离小鼠脾脏CIM’T细胞，采用流式细胞仪检测Treg细胞占CD^4＋T细胞的比例；分离Treg细胞，与屋尘螨提取液共同培养后测定上清液中白细胞介素-4（IL-4）及IL-10的含量；将Treg细胞与CD^4＋T细胞共同培养，观察其对CD^4＋T细胞增殖及IL4、IL-5、γ-干扰素（IFN-γ）分泌的影响。结果哮喘小鼠脾脏Treg细胞占CD^4＋T细胞比例明显下降；与正常组相比，哮喘小鼠脾脏Treg细胞IL-4、IL-10的分泌无明显差异；Treg细胞可显著抑制哮喘小鼠CD^4＋T细胞的增殖，并降低其IL-4的分泌，对IFN-γ的合成分泌无明显作用；使用anti—CD25mAb后，哮喘和正常小鼠Treg细胞的作用均被显著抑制。结论哮喘小鼠Treg细胞功能与正常对照组小鼠无明显区别，但数量显著下降。哮喘发病过程中Th2型反应占优势，与Treg细胞数量减少，对Th2型反应的抑制作用降低有一定关系。     

多发性骨髓瘤患者T淋巴细胞特征及HIF-1α相关性分析

目的 检测多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者骨髓中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor, HIF-1α)表达、T淋巴细胞分化、T淋巴细胞中耗竭相关基因表达,并探究HIF-1α与T淋巴细胞分化的相关性。方法 收集2021年1月～2022年2月华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院收治的9例MM患者(MM组)和3例缺铁性贫血(iron deficiency anemia, IDA)患者(IDA组)的病例资料,采用免疫组化方法检测两组患者骨髓中HIF-1α的表达阳性率,采用流式细胞学分析两组患者辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)、调节性T淋巴细胞(regulatory T cell, Treg)、Th22占CD4⁺T淋巴细胞中的百分比,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测两组患者T淋巴细胞中耗竭相关基因的表达。采用Pearson相关性评价HIF-1α与T淋巴细胞分化指标的相关性。结果 MM组患者骨髓标本中HIF-1α表达阳性率,外周血中Th17/Treg和Th22占CD4⁺T淋巴细胞中的百分比,T淋巴细胞耗竭相关基因NFATc1表达水平均高于IDA组。HIF-1α表达水平与Th22呈正相关,Th17/Treg与溶骨性病变程度呈正相关。结论 MM患者中,Th17/Treg、Th22水平和T淋巴细胞耗竭相关基因上调,存在T淋巴细胞分化和功能异常,且骨髓中高表达的HIF-1α与Th17/Treg和Th22水平呈正相关。     

哮喘小鼠CD4~ CD25~ 调节性T细胞数量及功能的改变

目的观察哮喘小鼠脾脏CD4 CD25 调节性T细胞(简称Treg细胞)数量及功能的改变。方法以屋尘螨提取液复制小鼠哮喘模型后,分离小鼠脾脏CD4 T细胞,采用流式细胞仪检测Treg细胞占CD4 T细胞的比例;分离Treg细胞,与屋尘螨提取液共同培养后测定上清液中白细胞介素-4(IL-4)及IL-10的含量;将Treg细胞与CD4 T细胞共同培养,观察其对CD4 T细胞增殖及IL-4、IL-5、γ-干扰素(IFN-γ)分泌的影响。结果哮喘小鼠脾脏Treg细胞占CD4 T细胞比例明显下降;与正常组相比,哮喘小鼠脾脏Treg细胞IL-4、IL-10的分泌无明显差异;Treg细胞可显著抑制哮喘小鼠CD4 T细胞的增殖,并降低其IL-4的分泌,对IFN-γ的合成分泌无明显作用;使用anti-CD25 mAb后,哮喘和正常小鼠Treg细胞的作用均被显著抑制。结论哮喘小鼠Treg细胞功能与正常对照组小鼠无明显区别,但数量显著下降。哮喘发病过程中Th2型反应占优势,与Treg细胞数量减少,对Th2型反应的抑制作用降低有一定关系。     

葎草花粉变应原核酸疫苗通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用

目的构建葎草花粉变应原核酸疫苗pcDNA3.1-Hum,并探讨其是否通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠
的免疫保护作用。方法双酶切pTripIEx2-Hum质粒以获取目的基因,定向插入pcDNA3.1(-)载体以构建pcDNA3.1-Hum核酸
疫苗并测序鉴定,转染至COS-7细胞以证实其表达。采用表达的目的蛋白刺激CD4+CD25- T细胞,验证其能否诱导Foxp3+Treg
细胞分化。使用pcDNA3.1-Hum免疫正常小鼠,检测特异性IgE、IgG2a水平以探讨其免疫原性、变应原性;免疫哮喘模型小鼠
以验证其免疫保护作用。结果测序证实该构建成功并可在真核细胞内表达;证实表达的目的蛋白可诱导CD4+CD25- T细胞向
Foxp3+Treg细胞分化。动物实验提示pcDNA3.1-Hum可诱导特异性IgG2a,不能诱导特异性IgE;可明显降低哮喘模型小鼠气
道炎症反应、气道高反应性;升高脾脏Foxp3+Treg细胞百分比;降低IL-4、升高IFN-γ水平。结论成功构建了pcDNA3.1-Hum核
酸疫苗,表达的目的蛋白可介导Foxp3+Treg细胞分化。动物实验证实该疫苗具有免疫原性及免疫保护作用,并提示其通过诱导
Foxp3+Treg细胞分化介导Th1倾向的免疫保护作用。     

卵巢癌患者外周血Th1/Th2及Treg/Th17细胞平衡关系

目的 探讨卵巢癌患者外周血中CD4+T细胞亚群:辅助T细胞(Th,包括Th1、Th2、Th17)及调节性T淋巴细胞(Treg)表达、平衡关系的变化,以及在卵巢癌发病机制中的作用.方法 流式细胞术检测30例卵巢癌疾病组及20例健康对照组外周血中Thl、Th2、Thl7、Treg表达占CD4+T细胞的百分率,并计算Th1/Th2、Th17/Treg的比值.结果 卵巢癌患者外周血中Th2、Th17及Treg亚群占CD4+T细胞的百分率明显高于健康对照组(P<0.05),而Th1百分率低于健康对照组(P<0.05),各亚群变化与临床分期相关,但与组织类型及细胞分化无关(P>0.05).卵巢癌组Th1/Th2比值降低,与对照组比较有统计学意义(P<0.05),卵巢癌患者存在Th2方向极化;卵巢癌组Treg/Th17比值升高,与对照组比较有统计学意义(P<0.05).结论 卵巢癌患者外周血中存在CD4+细胞亚群表达异常,存在Th1/Th2、Treg/Th17比值失衡,为卵巢癌临床免疫治疗提供理论支持.     

莫诺苷对小鼠T细胞体外活化与分化的影响

目的: 探讨山茱萸提取物莫诺苷对小鼠T细胞功能的影响及可能的机制。方法: 将C57BL/6小鼠脾脏制成单细胞悬液,采用抗CD3、抗CD28功能抗体模拟抗原刺激活化T细胞,分为对照组(不做任何处理)和莫诺苷组(10 μmol/L莫诺苷处理)。采用流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69、CD25表达水平,以及其增殖、凋亡与分化为Th1、Th2、Treg等细胞的情况;利用实时荧光定量PCR检测细胞中Tbx21、Gata3、淋巴样增强因子1(lymphoid enhance factor 1, LEF1)等mRNA水平;应用ELISA法测定培养上清液中IFN-γ、IL-4以及TGF-β含量;运用蛋白质免疫印迹技术测定细胞β 连环蛋白表达量。结果： 与对照组相比,莫诺苷组中活化T细胞向Th1、Th2、Treg分化比例增加(P<0.05),CD25活化标志增强,T细胞增殖标志Ki67有所增强,但增殖和凋亡差异均无统计学意义;IL-4和Treg细胞相关的TGF-β因子水平增加(P<0.05),但Th1细胞分泌的IFN-γ差异无统计学意义;Tbx21、Gata3、LEF1等mRNA水平均增加(P<0.05);蛋白质印迹显示β 连环蛋白表达明显上调(P<0.01)。结论： 山茱萸提取物莫诺苷可促进小鼠T细胞分化,其机制可能与Wnt信号通路有关。     

掌叶半夏提取物对宫颈癌荷瘤小鼠脾脏免疫的作用

 目的  观察掌叶半夏提取物(Pinellia extracts,PE)对HPV+TC-1荷瘤小鼠T细胞免疫应答的作用。方法  宫颈癌荷瘤小鼠建模后随分成4组:机对照组(生理盐水,0.2 mL/d,灌胃)、PE低剂量组(10 mg/kg, 0.2 mL/d,灌胃)、PE高剂量组(20 mg/kg,0.2 mL/d,灌胃)、CDDP组(4 mg/kg,0.2 mL/3 d,腹腔注射)。给药期间测瘤、描绘肿瘤生长曲线,21天后处死小鼠并计算抑瘤率,流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T细细胞以及Th1、Th2、Treg和Th17亚群的比例。结果  抑瘤率:CDDP组(29.82%)>PE高剂量组(21.73％)>PE低剂量组(8.23%);PE高剂量组和CDDP组CD4+和CD8+T细胞比例较阴性对照组均显著增多(P<0.01);PE两组Th1比例显著升高、Th2和Th17比例显著下降(呈现剂量依赖性),Treg亚群分泌TGF减少,而FOXP3水平增高。结论  PE能通过诱导CD4+T细胞向Th1型分化,抑制Th1/Th2漂移,改善Treg和Th17的比例,发挥抗肿瘤免疫作用。     

儿童急性呼吸窘迫综合征CD4+ T细胞亚群格局及其影响研究

目的研究儿童急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患儿中CD4+ T细胞亚群格局的变化及其对ARDS的关系。方法选择61例ARDS患儿,分为轻度组（25例）、中度组（20例）和重度组（16名）。同时,选取同期61例健康儿童作为对照组,采用流式细胞仪检测ARDS患儿和对照组外周血中T细胞总量、调节性T细胞（Treg）、Th17、Th1和Th2占CD4+ T细胞的比例。并观察CD4+ T细胞亚群主要细胞因子γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4、IL-17A、IL-17F的变化情况。结果与对照组比较,ARDS患儿T细胞总量、Th1、Th2、Th17细胞数量、Treg细胞、Th17/Treg比例、IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F因子均有不同程度的升高（P＜0.05~P＜0.01）;Spearman相关分析发现,ARDS患儿外周血IL-4、Foxp3、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平与小儿危重病评分均呈负相关关系（P＜0.01）。结论CD4+ T细胞亚群格局变化和ARDS发病密切相关,CD4+ T细胞亚群格局变化促进了ARDS的发生发展,形成了一个相互作用的炎症网络。     

新型Th9细胞及其与包虫病关系的研究进展

CD4+T细胞亚群中最早被发现且研究的是Th1和Th2细胞,近年来不仅对调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞亚群17(Th17)的研究显著增加,还报道了一种新型Th细胞亚群,即辅助性T细胞亚群9(Th9).新近研究表明,在某些特定条件下,存在着不同于Th1、Th2和Th17的CD4+Th细胞亚群,即Th9.它有着独特的分化机制和免疫应答机制,可以产生大量的IL-9.Th9细胞已被证明其不仅参与了各种自身免疫性疾病,还参与了包虫病感染后的免疫应答过程,并且有利于棘球蚴继续寄生在宿主体内.包虫病的"免疫逃避"机制与辅助性T细胞的免疫应答有密切的关系.     

养阴清热方通过下调JAK/STAT信号通路调节Treg/Th17平衡的实验研究

  目的  研究养阴清热方(YHF)对脂多糖(LPS)导致的小鼠Treg/Th17失衡的影响及机制。  方法  磁珠分选法提取小鼠脾脏CD4+ T细胞, 用LPS刺激CD4+ T细胞, 再以1、2、4 mg · mL-1的YHF水提液分别进行干预。MTT法检测细胞增殖情况; 流式细胞术检测CD4+ T细胞亚群Treg/Th17比例; ELISA法检测细胞上清中细胞因子IL-10、TGF-β、IL-6、IL-12p70的含量; 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中Foxp3、RORγt及信号分子JAK/STAT的表达。  结果  HPLC检测鉴定出YHF水提液中8种有效成分, 分别为羟基红花黄色素A、虎杖苷、芦丁、2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、白藜芦醇、槲皮素、大黄素和姜黄素。YHF水提液可以剂量依赖性地抑制LPS刺激的小鼠CD4+ T细胞的增殖(P < 0.05), 增加Treg的比例(P < 0.05), 降低Th17的比例(P < 0.01), 促进培养上清中Treg相关的抗炎因子IL-10和TGF-β的分泌, 抑制Th17相关的致炎因子IL-6和IL-12p70的分泌。1、2、4 mg · mL-1 YHF均能增加Foxp3蛋白的表达(P < 0.05), 减少RORγt蛋白的表达(P < 0.01)。1、2、4 mg · mL-1 YHF均能降低JAK2、STAT3及其磷酸化蛋白的表达(P < 0.05)。4 mg · mL-1 YHF与JAK2特异性抑制剂AG490联用可以增加培养上清IL-10和TGF-β含量(P < 0.05), 降低IL-6和IL-12p70含量(P < 0.05), 而且可以显著降低p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白表达(P < 0.01,P < 0.001), 增加Foxp3蛋白表达(P < 0.01)。  结论  YHF可以有效抑制LPS诱导的小鼠CD4+ T细胞增殖, 通过抑制JAK2和STAT3信号分子表达, 增加Foxp3的表达和Treg数量, 减少RORγt的表达和Th17数量, 调节Treg/Th17平衡及抗炎细胞因子和促炎细胞因子的分泌。      

日本血吸虫感染小鼠外周血CD4+T细胞亚群动态变化的研究

目的 了解日本血吸虫感染小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群水平的动态变化情况,探讨感染进程中CD4⁺T细胞亚群的免疫调控作用。方法 通过日本血吸虫尾蚴腹贴法建立日本血吸虫感染小鼠模型,将18只6周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分成正常对照组和日本血吸虫感染组,每组9只。 通过流式细胞染色计数的方法检测感染3周、5周及8周后小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群中Th1、Th2、Th17、Treg细胞变化情况。结果 随着日本血吸虫感染进程,与正常对照小鼠相比,感染小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群中Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例均显著增加。不同细胞亚群比例增加的趋势不尽相同,其中Th1细胞在感染第3周占比较高但其增长较为缓慢,而感染前3周Th2、Treg细胞占比较低但其增加幅度较大,在第8周达到峰值;Th17细胞比例在感染前3周基本无变化,随后显著增加。结论 日本血吸虫感染引起宿主CD4⁺T细胞亚群比例发生变化,本研究发现感染显著增加小鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例,感染后3周内小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群以Th1细胞为主,5周后Th2、Th17、Treg细胞逐渐占主导地位。本结果为研究日本血吸虫病免疫病理机制和特征提供基础。