重庆地区69例丙型肝炎病毒感染基因分型研究

目的：探讨重庆地区HCV流行的主要基因型。方法：提取69份血清标本的HCV RNA，通过逆转录套式PCR（RTnested-PCR)扩增5'端非编码区（5'NCR)，以4种限制性内切酶BstUⅠ，NciⅠ，HaeⅢ,RsaⅠ对扩增产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP），依据不同的酶切电泳图谱确定HCV基因型。结果：69份HCV感染者血清标本有60份可以通过上述方法进行基因分型，其中主要基因型是1b,2a分别占36．24％和31．88％。结论：HCV－1b,2a仍然是重庆地区主要的基因型，但其所占比例不如中国其它地区高，说明HCV的分布呈地域依赖性。     

乙型肝炎病毒宫内传播的分型

目的：研究乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）分型在乙肝病毒宫内传播的特点。方法：对广州市三家医院的135例HBsAg孕产妇及其139例新生儿外周血及部分婴儿随访标本，巢式PCR扩增HBV S区基因部分片段，限制性核酸内切酶酶切PCR产物，比较酶切片段长度多态性（RFLP），以确定HBV基因型。直接测序与Genebank相应序列比较。结果：7例新生儿发生HBV的宫内传播，阳性率为7／139（5．0％），PCR－RFLP方法检测到B，C型各3／7例，D基因型1／7例。宫内传播过程中母婴HBV的基因型保持一致。S基因直接分型与上述结果一致。该7组母婴均无乙肝临床症状与体征。结论：广州地区母婴宫内传播HBV以C，B基因型为主，宫内传播过程及免疫压力下HBV－DNA发生碱基突变，但未发生在限制性内切酶的酶切位点上，尚不能由HBV基因分型对HBV感染儿的预后进行推测。     

一种简单、稳定、可靠的屏氧酶1基因多态性分析法

目的：建立一种简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。方法：取外周静脉血100μl，用ROSE法提取基因组DNA，用两对引物：P192F 5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′,P192R 5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；P55F 5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′,P55R 5′-TTT AAT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3分别进行PCR扩增，用限制性内切酶AlwI,NlaⅢ对两种PCR产物分别进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的两个PCR产物在192、55多态性位点大小分别为99bp、170bp。Alw I酶切后，凝胶电脉得到完全酶切（66bp,33bp)，部分酶切（99bp、66bp、33bp)，未被酶切（99bp)三种类型DNA片段（RR，QR，QQ基因型）；NlaⅢ酶切后，凝胶电脉得到部分酶切（170bp,126bp,44bp)，未被酶切（170bp)两种类型DNA片段（LM，LL基因型）。经双盲重复检测，结果一致。应用此方法对胃癌患者血样标本检测，发现其PON1基因多态性在192位点频率较高。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。     

PCR-RFLP与多引物对PCR乙肝病毒基因分型方法的比较

目的　PCR RFLP与多引物对PCR的乙肝病毒基因分型方法学比较。方法　自行设计利用限制性内切酶MboⅠ、BsTNⅠ、BsmAⅠ、HpaⅡ酶切S基因片段鉴定HBV基因型 (A～F)的PCR RFLP方法。分别利用该方法和多引物对PCR对贵州地区 14 9份HBsAg、HBVDNA阳性血清进行病毒基因分型。结果　 14 9份乙肝患者血清中PCR -RFLP方法成功分型 12 8份 (85 .91% ) ,多引物对PCR方法成功分型 10 8份 (72 .4 8% )。两种方法均能成功分型的标本 10 7份 ,其中B型 5 2份 ,C型 5 5份 ;两种方法分型结果完全一致。结论　本PCR RFLP基因分型方法与多引物对PCR方法的分型结果一致 ,但PCR RFLP方法的成功率及敏感度较高 ,图谱简单易读 ,适用于大样本筛检及临床应用     

湖北省不同年份汉坦病毒的RT-PCR检测及分型

目的：探讨湖北省不同年份引起肾综合征出血热的汉坦病毒的主要型别，为进一步研究该型汉坦病毒的基因变异打下基础。方法：根据汉坦病毒M基因片段G1编码区核苷酸序列设计I型和Ⅱ型分型引物，利用RT—PCR对105份不同年份的病程在7日以内的肾综合征出血热(HFRS)患(经临床诊断和ELISA确诊)血清标本进行检测及基因分型，并对扩增出的基因片段选用3种限制性内切酶AluI、RsaI、MboI进行酶切分析。结果：用I型引物通过：RT—PCR检测75份血清标本(1996～2000年)和30份血清标本(1986～1987年)的阳性率分别为77．3％和10％，而用Ⅱ型引物检测前阳性率为8．0％，后均为阴性。对4份I型引物扩增产物用3种限制性内切酶进行酶切分析，发现4份阳性产物其限制性片段长度多态性均与I型汉坦病毒标准株76～118完全不同，但其中3份与I型汉坦病毒湖北地方株HV114相同，1份与HV114不完全相同。结论：不同年份引起湖北地区HFRS的主要毒株均为I型汉坦病毒(HTN)湖北地方株。     

乙型肝炎病毒宫内传播的分型

目的研究乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)分型在乙肝病毒宫内传播的特点。方法对广州市三家医院的135例HBsAg孕产妇及其139例新生儿外周血及部分婴儿随访标本,巢式PCR扩增HBVS区基因部分片段,限制性核酸内切酶酶切PCR产物,比较酶切片段长度多态性(RFLP),以确定HBV基因型。直接测序并与Genebank相应序列比较。结果7例新生儿发生HBV的宫内传播,阳性率为7/139(5.0%),PCR-RFLP方法检测到B、C型各3/7例,D基因型1/7例。宫内传播过程中母婴HBV的基因型保持一致。S基因直接分型与上述结果一致。该7组母婴均无乙肝临床症状与体征。结论广州地区母婴宫内传播HBV以C、B基因型为主,宫内传播过程中及免疫压力下HBV-DNA发生碱基突变,但未发生在限制性内切酶的酶切位点上,尚不能由HBV基因分型对HBV感染儿的预后进行推测。     

CYP2A6基因多态性的一步PCR-RFLP分析法

目的：建立CYP2A6基因多态性的一步PCR－RFLP分析法。方法：取外周静脉血100μl，用Rose法提取基因组DNA，用特异性引物CYP2A6F03：5′-CTG ATC GAC TAG GCG TGG TA-3′,cyp2a6r06:5′-CGT CCT GGG TGT TTT CCT TC-3′进行一步PCR扩增，用限制性内切酶Dde I,XcmI对PCR产物进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的PCR产物大小为214bp，部分血样标本未获得PCR扩增产物，判为CYP2A6缺失基因型（CYP2A6 del/CYP2A6del)。DdeI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6v2基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段；XcmI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6vl/CYP2A6wt基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段。其中，部分血样标本同时被DdeI和XcmI部分酶切（CYP2A6v2/CYP2A6vl基因型）。应用此方法检测，发现中国人群胃癌患者存在CYP2A6等位基因多态性。经双盲重复检测，上述结果一致。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、特异的CYP2A6基因多态性分析法。     

等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变

目的：建立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测方法。方法：基因组DNA从HEL细胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特异性-PCR（Allele specific—PCR，As—PCR）和限制性内切酶消化的方法检测基因组中JAK2V617F突变。结果：本AS—PCR法可对JAK2基因扩增出364bp的内参照条带，当存在JAK2V617F突变时，又可以扩增出203bp的突变条带。只有野生型内参照条带364bD可被BsaXⅠ消化切割。结论：AS—PCR法和限制性内切酶法是检测JAK2V617F突变的敏感特异的检测方法，可以成功应用于临床检测。     

原发性心肌病β肌球蛋白重链基因突变研究

目的 探讨β－肌球蛋白重链（βMHC）基因点突变与肥厚型心肌病（HCM）及扩张型心肌病（DCM）发病的关系。方法 选择56例原发性心肌病病人（HCM13例，DCM43例）及53例健康对照，应用聚合酶链反应（PCR）限制性扩增心脏β－肌球蛋白重链基因第13、14外显子，用DdeⅠ、NⅠaⅢ限制性内切酶酶解其扩增产物，分析有无8848位及9124位点突变。结果 1例扩张型心肌病病人出现8848位点突变应产生的394bp片段，提示该病人可能存在8848位点突变。HCM病人未发现突变。结论 β－肌球蛋白重链基因可能是DCM遗传易感性的基因标志之一。     

PCR/RFLP对临床标本沙眼衣原体直接基因分型

建立泌尿生殖系统沙眼衣原体感染阳性标本直接基因分型方法。先用敏感的扩增沙眼衣原体特异质粒的引物扩增５００份临床标本，初筛选出１００份阳性标本再用扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）基因的引物扩增，并用嵌套式ＰＣＲ使阳性标本能扩增出ＭＯＭＰ基因，对获得的ＭＯＭＰ基因用限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）方法进行基因分型，并用银染观察结果。其中Ｅ型比例最高，占４７％；Ｆ型为１６％；Ｄａ、Ｇ型均为６％；Ｂａ、Ｄ型各占５％；Ｈ型及Ｋ型均为１％，混合型Ｋ／Ｆ型２％；混合型Ｄ／Ｊ、Ｅ／Ｇ均为１％；未能分型有９％。     

慢性B淋巴细胞白血病B细胞B7.2分子表达缺陷的研究

目的研究比较慢性B淋巴细胞白血病(BCLL)与正常人外周血中B细胞的B7.1、B7.2分子的表达水平,探讨其表达与慢性B淋巴细胞白血病发病机制的关系.方法将23例BCLL患者分为0～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期两组,并设正常对照组.乙聚蔗糖-泛影钠淋巴细胞分离液分离出BCLL患者及正常人的外周血单个核细胞,体外培养24h后,流式细胞仪检测B细胞B7.1、B7.2表达的百分率;BCLL组与对照组及0～Ⅱ期组与Ⅲ～Ⅳ期组间分别进行t检验.结果与正常对照组相比,Bell患者外周血B细胞胞.2分子的表达率(20%±13%)明显低于正常人(58%±12%,P＜0.O5),B7.1单独表达率及B7.1、B7.2同时表达率在正常人与BCLL两组比较差异无显著意义(P＞0.05);BCLL组中0～Ⅱ期组与Ⅲ～Ⅳ期组B7.2的表达率分别为25%±17%及17%±8%(P＞0.05).结论外周血B细胞B7.2分子的表达存在缺陷,这可能是此病的发病机制之一及机体不能免疫清除白血病细胞的重要原因.     

急性B淋巴细胞白血病B细胞B7分子表达缺陷

目的　探讨B7分子表达与急性B淋巴细胞白血病 (BALL)发病机制的的关系。方法　Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离出患者及正常人的外周血单个核细胞 ,体外培养 2 4h后 ,流式细胞仪检测B细胞细胞膜表达B7.1、B7.2表达的百分率 ;BALL组与正常对照组作组间比较。结果　与正常对照组相比 ,BALL组B7.1、B7.2表达及B7.1、B7.2双表达的百分率明显低于正常人 (P <0 .0 5 )。结论　BALL外周血B细胞B7分子的表达存在缺陷 ,可能是BALL的发病机制之一及白血病细胞逃避机体“免疫监视”的重要原因。     

Multiplication of hepatitis B virus in fulminant hepatitis B

The presence in serum of hepatitis B e antigen (HBeAg) and hepatitis B virus DNA, which are each regarded as reflecting multiplication of hepatitis B virus, were looked for one to five days after the onset of hepatic encephalopathy in 64 patients with fulminant hepatitis B. HBeAg and hepatitis B virus DNA were found in the serum of only 24 (37%) and six (9%) patients, respectively. Hepatitis B virus DNA was absent from the serum in all 13 patients positive for anti-HBs. These findings indicate that replication of hepatitis B virus stopped after the onset of hepatic encephalopathy in most of the patients and support the view that an enhanced immune response stops the replication. Agents that inhibit viral multiplication would probably not have any effect at this stage of the disease.     

HBsAg阴性乙型肝炎患者血清HBV-DNA检测的临床意义

应用斑点杂交方法对36例HBsAg阴性的各种类型的乙型肝炎患者进行了血清HBV-DNA的检测,33例获得阳性结果。目前认为血清和肝组织HBV-DNA的检测是判断HBV感染和复制的特异和敏感方法,对于HBV感染的临床诊断和流行病学的研究有一定意义。     

乙肝免疫球蛋白联合乙肝疫苗预防乙型肝炎母婴传播的疗效评价

目的：探讨乙肝免疫球蛋白联合乙肝疫苗预防乙肝病毒母婴传播的临床疗效。方法：将120例母亲乙肝表面抗原阳性的新生儿随机分为治疗组70例和对照组50例,对照组新生儿于出生后24 h内注射乙肝疫苗,治疗组新生儿母亲于孕28、32、36周分别注射乙肝免疫球蛋白,新生儿于出生后24 h内和出生后1个月分别注射乙肝免疫球蛋白。结果：治疗组和对照组新生儿脐血HBsAg阳性率分别为7.14%和22.0%,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组新生儿出生后1、6、12个月的HBsAg阳性率均明显低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：乙肝免疫球蛋白联合乙肝疫苗可有效地阻断乙肝病毒母婴传播,对乙肝母婴传播的预防具有重要意义。     

乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）检测的临床价值

目的探讨乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）诊断乙型肝炎的意义。方法采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）、乙肝病毒前S1（PreS1）,采用荧光定量PCR方法检测HBV DNA。结果 HBeAg阳性样本中乙型肝炎病毒大蛋白与HBV DNA的检出无显著性差异（χ2=2.46,P〉0.05）;乙肝病毒前S1与HBV DNA的检出有显著性差异（χ2=17.34,P〈0.01）;乙型肝炎病毒大蛋白吸光度值（OD值）与HBV DNA拷贝数相关系数r=0.912,P〈0.05。在HBeAg阴性样本中LHBs的吸光度均值和阳性率均呈线性增加,Pre S1的吸光度均值以及阳性率与HBV DNA拷贝数均不相关。结论乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）与HBV DNA有良好正相关,与乙肝前S1（Pre S1）相比,LHBs可更好反映临床乙肝病毒复制水平。     

大学生乙型肝炎疫苗接种与乙型肝炎相关性分析

目的 :探讨乙肝疫苗接种对大学生乙型肝炎发病的预防作用。方法 :采用分组对照方法 ,对 1995～ 2 0 0 0年入校大学生乙肝疫苗接种与乙肝发病情况进行分析。结果 :接种组发病 1例 ,发病率为 15 .17/10万 ,未接种组发病 2 6例 ,发病率为5 15 .16 /10万 (P <0 .0 0 5 )。男生的发病率为 191.33/10万 ,女生的发病率为 15 .12 /10万 (P <0 .0 0 5 )。结论 :接种乙肝疫苗是预防大学生乙型肝炎的有效方法。