幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的表达、纯化与免疫学活性检测

目的:在大肠杆菌TB1(pMAL-c2X)中表达幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白,并探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础.方法:以重组质粒pET30a(+)-ureB-omp11为模板获得融合基因ureB-omp11片段,并插入到原核表达载体pMAL-c2X中进行融合蛋白的表达,用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印记法对免疫小鼠血清进行检测.结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在134 000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫学活性.结论:成功构建了Hp MELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌融合基因hspA-ureB重组质粒的构建及其编码蛋白抗原性预测

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)郑州分离株MEL-HP27的hspA-ureB融合基因的克隆,并运用生物信息学软件预洲融合蛋白HspA-UreB的空间结构和抗原性。方法：从重组质粒pNHA27和pNUB27分别纯化同收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序插入温控表达载体pBV220中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。利用生物信息学软件和Genbank数据库分析hspA-ureB表达蛋白的抗原性和空间结构。结果：质粒酶切电泳和特异PCR均可见2．06kb的融合基因片段。生物学软件分析显示：MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的长度为689个氨基酸,蛋白相对分子质量为76500,等电点为5．79,具有5个抗原活性结构域。结论：成功构建了MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的重组表达质粒,编码融合蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为H.pylori疫苗候选抗原。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的温控表达及其免疫反应性检测

目的：在温控表达载体pBV220中实现幽门螺杆菌(H．pylori)融合蛋白HspA-UreB的表达,并研究其免疫反应性。方法：含重组表达质粒pBV-HU27的人肠杆菌DH5α经30℃增菌后,存42℃下诱导表达,SDS-PAGE分析融合蛋白表达含量,与H．pylori全菌免疫小鼠血清和H．pylori感染患者血清进行Western blot分析,检测融合蛋白的免疫反应性。结果：SDS-PAGE分析结果显示存76500处出现特异蛋白带,诱导4h即可达到最高量,融合蛋白HspA-UreB占全菌蛋白含量的10％,该融合蛋白可以被H．pylori免疫小鼠血清和H．pylori阳性患者血清中的相应抗体所识别。结论：H．pylori融合蛋白HspA-UreB可以在温控表达载体中正确表达,且具有良好的免疫反应性。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白包涵体的纯化及活性鉴定

目的：建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位-尿素酶B亚单位(HspA-UreB)融合蛋白包涵体的方法。 方法：基因工程重组大肠杆菌BL21(pET-HU27)诱导表达的HspA-UreB融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性,在A¨KTA FPLC上运用HiTrap Chelating HP分离纯化,用SDS-PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量,用Western blotting对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。 结果：纯化后HspA-UreB融合蛋白的纯度＞90%,含量达0.25 g•L^-1,并可以被HspA-UreB融合蛋白免疫小鼠血清识别。 结论：成功地建立了从包涵体中纯化高纯度HspA-UreB融合蛋白的方法。     

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：观察幽门螺杆菌(H．pylori)flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法：用PCR方法扩增flaA基因,然后插入原核表达载体pMAL-c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果：特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体,并以融合蛋门形式MBP-FLA高效表达,约占细胞总蛋白的28％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清和小鼠H.pylori全菌抗体发生特异反应。结论：成功构建了能高效表达H．pylori FlaA蛋白的重组质粒,为H．pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2 -NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的诱导表达与活性鉴定

目的：优化幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白诱导表达的条件,以提高目的蛋白的产量。方法：表达幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的重组基因工程菌BL21（pET-HU27）在不同温度下（25℃、37℃）以不同的IPTG浓度（0.3、1.0和2.0 mmol·L^-1）和不同的培养基（LB、SOC）中分别诱导表达不同时间,表达产物经超声破碎后,进行融合蛋白可溶性分析,并用Western blotting 对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果显示,37℃时,LB培养基中,0.3 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导5 h时,融合蛋白的含量最高为21.51%;25℃,SOC培养基中,1.0 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导8 h时,可溶性HspA-UreB融合蛋白含量最高为34.58%,表达产物能够被免疫小鼠血清识别。结论：实现了幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白在原核细胞中的高效表达,并具有良好的免疫活性,为进一步开发应用以该融合蛋白为抗原的幽门螺杆菌疫苗打下了坚实的基础。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白可溶性表达产物的纯化及活性鉴定

目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌HspA UreB融合蛋白可溶性表达产物的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌BL2 1(pET HU2 7)诱导表达产物 ,超声破碎后收集上清 ,上清经盐析初步纯化后 ,在 ¨AKTAFPLC上运用HiTrapChelatingHP分离纯化 ,用SDS PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量 ,用West ern blot对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。结果 :纯化后HspA UreB融合蛋白的纯度 >90 % ,含量达 0 15mg/ml,并可以被免疫小鼠血清识别。结论 :建立了从BL2 1(pET HU2 7)可溶性表达产物中纯化高纯度HspA UreB融合蛋白的方法 ,为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的:原核表达呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS1蛋白,并对其免疫特性进行研究.方法 采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a(+)载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性.结果 重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确,经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达,表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42 000 Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Western blot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15 000 Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带.结论 NS1基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

S100A16基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的:构建S100A16原核表达载体,制备S100A16蛋白多克隆抗体并初步鉴定?方法:RT-PCR扩增得到小鼠肝脏组织的S100A16基因,将此片段克隆到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21(DE3)?IPTG诱导融合蛋白表达,以亲和层析的方法纯化His-S100A16融合蛋白?纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫新西兰白兔制备抗血清?分别采用ELISA和Western blot方法检测抗体效价和特异性?结果:经双酶切和核酸序列分析证实成功构建pET-28a-S100A16原核表达质粒?考马斯亮兰染色结果证实IPTG可有效诱导融合蛋白表达?用纯化融合蛋白免疫新西兰白兔得到的S100A16抗体血清,经ELISA和Western blot检测结果显示该抗体效价高,特异性好?结论:构建带有His标签的S100A16原核表达载体,并获得高纯度His-S100A16融合蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究S100A16生物学功能奠定基础?