共价结合血管内皮生长因子促进内皮祖细胞在去细胞瓣上的粘附和增殖

目的对去细胞主动脉瓣进行聚乙二醇(PEG)交联和血管内皮生长因子(VEGF)共价结合,以改善去细胞主动脉瓣生物学性能。方法枝化状聚乙二醇末端的丙烯酰基与引入到去细胞主动脉瓣上的巯基,通过迈克尔加成反应完成对去细胞主动脉瓣的PEG交联;通过PEG交联去细胞主动脉瓣上的未饱和丙烯酰基与VEGF中半胱氨酸残基上的巯基发生另一个迈克尔加成反应,对去细胞主动脉瓣进行VEGF共价结合,酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定VEGF修饰效果;在去细胞主动脉瓣、PEG交联去细胞主动脉瓣和VEGF共价结合的PEG交联去细胞主动脉瓣上种植内皮祖细胞,培养10 d后行瓣膜上DNA含量测定、苏木素-伊红染色和扫描电镜。结果免疫荧光和ELISA检测显示:每片PEG交联去细胞主动脉瓣最大结合(908.94±0.27)pg VEGF;与去细胞主动脉瓣和PEG交联去细胞主动脉瓣相比,VEGF共价结合的PEG交联去细胞主动脉瓣明显促进内皮祖细胞的黏附和增殖,并且可在瓣膜表面形成一层连续的单细胞层。结论借助PEG,VEGF能有效地共价结合去细胞主动脉瓣,促进细胞的粘附和增殖,有利于组织工程心脏瓣膜的构建。     

表达内皮抑素基因的内皮祖细胞治疗肝癌的初步研究

目的:观察内皮抑素(endostatin,ES)基因转染的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对小鼠肝癌细胞H22增殖的影响,探讨联合自体EPCs和ES基因治疗肝癌的可行性和有效性?方法:构建表达ES基因的慢病毒载体,培养小鼠骨髓源EPCs,运用qPCR检测培养内皮细胞表面标记CD31?血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)?血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)表达,电镜观察内皮细胞特征小体?实验分EPCs组?EPCs+LV空病毒载体组?EPCs+ES组?CCK-8法检测各组细胞增殖的情况?同时构建原位肝癌小鼠模型,尾静脉注射3组细胞后不同时间点处死小鼠,测量肿瘤大小并进行统计分析?结果:①酶切和测序?PCR鉴定证实成功构建慢病毒载体pLenti6.3-ES-Monomer-DsRed;②qPCR显示培养细胞表达内皮细胞标志CD31?VEGFR?vWF,透射电镜下在细胞质内可见多个散在内皮细胞特征性Weibel-Palade小体(WP小体);③慢病毒载体Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed转染小鼠骨髓源性EPCs后荧光显微镜下可见细胞呈红色荧光;EPCs+ES组细胞上清较对照组上清液对小鼠肝癌细胞H22体外增殖具有明显抑制作用,体内实验显示EPCs+ ES组肝癌生长速度慢于对照组?结论:小鼠骨髓源单个核细胞体外可以诱导培养为内皮祖细胞,负载ES基因的EPCs体外可以抑制小鼠肝癌细胞H22的增殖,体内可以抑制小鼠肝癌生长?     

去细胞猪主动脉瓣膜支架的生物学特性

目的探讨以Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞后的组织工程心脏瓣膜支架的生物学特性。方法经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶处理新鲜猪主动脉瓣膜,去除内皮细胞和间质细胞,常规苏木精伊红染色,电子扫描显微镜检查,评价去细胞效果,并检测去细胞瓣叶的力学特性、可溶性蛋白含量、同时行兔皮下包埋实验,观察其免疫反应性。结果Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶能有效去除细胞成分,获得组织工程心脏瓣膜支架。去细胞瓣叶与新鲜瓣叶有相同的拉伸强度-拉伸率曲线。可溶性蛋白含量明显降低,去细胞瓣叶的免疫反应性明显降低。结论经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞处理的猪主动脉瓣膜可以做为组织工程瓣膜支架。     

去细胞组织工程心脏瓣膜构建的实验研究

目的:探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法:测定瓣叶去细胞前、后的生物力学性能;观察去细胞瓣叶上内皮细胞生长情况。结果:瓣叶去细胞可获得完整无细胞的纤维支架,瓣叶去细胞前、后的生物力学性能无差异;内皮细胞在去细胞瓣叶表面生长,形成一层基本连续的细胞层。结论:去细胞瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程瓣膜;内皮细胞种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽固定去细胞瓣构建组织工程瓣膜的实验研究

目的：研究促黏附分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽对去细胞瓣组织工程心脏瓣膜（TEHV）构建的影响：方法：酶＋去污剂法制备去细胞瓣天然支架，应用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP，使GRGDSPC肽与之稳定纳合，然后表面种植大鼠肌成纤维细胞以构建TEHV文验组采用GRGDSPC肽固定去细胞瓣，对照组则为未处理去细胞瓣．体外培养1周后取瓣叶，作苏木精-伊红（H-E）染色和扫描电镜观察，检测羟脯氨酸和DNA含量，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测瓣膜Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶（LOX）mRNA表达：结果：与对照组比较，实验组形态学显示细胞紧密联合且胞外基质丰富，羟脯氨酸和DNA含量值增高，Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强：结论：RGD肽表面修饰去细胞瓣，提高天然支架细胞黏附性，促进种子细胞生长、繁殖与细胞外基质分泌，有利TEHV构建。     

生物瓣材料新型化学改性和内皮化的实验研究

目的 通过对生物瓣材料应用新型化学改性剂2,3-丁二醇去除戊二醛的细胞毒性,实现人工内皮化,观察内皮细胞生长情况.方法 对戊二醛固定的生物瓣材料牛心包片分两组处理:A组应用2,3-丁二醇改性处理,再用Ⅰ型胶原蛋白预覆;B组为对照组,不作任何处理.用消化法获取猪血管内皮细胞,体外培育至第3代,以高浓度种植至牛心包片表面,计算种植后第1、3、5、8天的活细胞数.体外孵育8 d后行第Ⅷ因子检测和扫描电镜(SEM)观察.结果 A组牛心包片表面细胞生长活跃,在第3、5、8天的细胞数明显多于B组,在第5天以后B组细胞全部死亡.种植后第8天,A组第Ⅷ因子相关抗原检测阳性率达90%,SEM显示A组牛心包片表面形成内皮细胞单层,细胞与基质间有微丝连接形成.而对照组牛心包片表面无细胞生长.结论 经过2,3-丁二醇化学改性后可实现生物瓣材料的人工内皮化,并能形成稳定的微丝连接结构,具有良好的临床应用前景.     

戊二醛固定的牛颈静脉带瓣管道的钙化实验研究

目的检测戊二醛固定的牛颈静脉带瓣管道的在体钙化程度,评价用戊二醛固定牛颈静脉带瓣管道的可行性,为寻找最佳的固定方法提供基础资料.方法将戊二醛处理后的牛颈静脉管壁及瓣叶组织用肝素进行处理,植入脱乳的SD大鼠背部皮下,60 d后取出,进行自身对照,采用原子吸收分光光度法检测组织钙含量,HE染色、Von-Kossa染色进行形态学检测,透射电镜观察超微结构变化.结果包埋前的牛颈静脉瓣膜、管壁试片平均钙含量分别为(1.84±0.75)、(0.53±0.22)μg/mg干重,包埋后的牛颈静脉瓣膜、管壁试片平均钙含量分别为(16.23±8.32)、(151.00± 23.78)μg/mg干重,两组相比有显著差别(P＜0.001).光镜及电境下显示包埋前的牛颈静脉瓣膜、管壁内皮保存完整,组织结构紧凑,胶原纤维结构保持良好;包埋后的牛颈静脉瓣膜、管壁则内皮残缺,结构疏松,胶原纤维破坏严重.结论戊二醛交联的牛颈静脉带瓣管道,可见明显钙化.瓣膜钙化较轻,管壁钙化严重.     

新型活性修饰对聚乳酸组织工程骨支架上种子细胞生物学行为的影响

目的探讨氨等离子体改性、酰胺键接枝甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(GRGDS)短肽的活性修饰方法对消旋聚乳酸(PDLLA)组织工程骨上慢病毒转染红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞生物学行为的影响。方法制备圆片状直径8 mm、厚1 mm的PDLLA三维多孔支架,分为3组:表面氨基化PDLLA(A组),接枝肽A/PDLLA(PA组),以未经处理的PDLLA(P组)作为对照组。CyQuant NF和AlamarBlue分别检测支架上细胞的增殖和代谢活性;钙黄绿素进行矿化荧光染色,荧光显微镜观察支架上钙盐沉积以及RFP-BMSCs的贴附与增殖;扫描电镜观察细胞的贴附。结果接种细胞后各时间点,3组材料上细胞均能增殖,组间细胞数量差别均有统计学意义(P<0.001),PA组>A组>P组。除第10天(P=0.077)和第12天(P=0.491)PA组和A组间细胞数量差异无统计学意义外,其余各时间点,PA组数量均明显高于A组。随着时间的延长,两组间细胞数量逐渐接近。细胞代谢活性检测与增殖检测结果近似,骨支架上细胞增殖程度越高,其代谢越活跃。荧光显微镜观察,A组和PA组材料上RFP-BMSCs较P组增殖活跃;钙盐沉积荧光染色显示,第14天和第21天,绿色荧光强度PA组>A组>P组。扫描电镜显示,PA组材料能获得较A组更好的细胞贴附,P组细胞较稀疏。结论氨等离子体改性接枝GRGDS肽的新型活性修饰PDLLA骨支架,能明显促进RFP-BMSCs为种子细胞的贴附、增殖、代谢与矿化。     

去细胞猪主动脉瓣RGD肽表面修饰促进细胞黏附的实验研究

目的 研究RGD肽(精-甘-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)表面修饰的去细胞瓣对细胞黏附性的影响.方法 采用胰蛋白酶+TritonX-100法制备去细胞猪主动脉瓣(acellularized porcine aortic vavle,APAV),并用环氧氯丙烷(EC组)、戊二醛+环氧氯丙烷(GE组)以及再分别用RGD肽修饰(EC+RGD组、GE+RGD组)的各不同处理去细胞瓣组,与YGRGDSP肽(酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸)反应,通过茚三酮法、荧光标记显示法比较各组的结合率.种植大鼠主动脉肌成纤维细胞(MFBs),沉淀法检测细胞黏附率.结果 茚三酮显示多肽可很好的交联到EC、GE组,最佳反应条件为:室温,1.5 mg/mL RGD、pH7.4、持续振荡12 h.经RGD肽修饰的EC,GE组细胞黏附率较单纯APAV提高(P<0.05).结论 利用EC,可将YGRGDSP肽以共价接枝的方式固定到APAV支架进行表面修饰,EC联合RGD肽表面修饰去细胞瓣可显著改善细胞黏附性.     

聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶构建新型组织工程瓣膜支架

目的 利用聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜构建组织工程瓣膜支架,并研究其生物学和生物力学性能.方法 由聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜制备复合支架瓣膜,由戊二醛与瓣膜交联制备戊二醛交联瓣膜,通过组织学染色,扫描电镜,细胞增殖实验,生物力学测试研究复合支架瓣膜的生物学以及生物力学性能,并与戊二醛交联瓣膜进行比...