人牙龈、牙周韧带细胞及牙槽骨细胞的体外培养研究—Ⅰ．三种细胞生物学特性比较

目的 :观察体外培养的牙周组织三种主要功能细胞的生物学特性差异。方法 :对人牙龈成纤维细胞 (GFs)、牙周韧带细胞 (PDLCs)及牙槽骨细胞 (ABCs)进行分离、培养、传代后 ,用MTT比色法、碱性磷酸酶测定法、考马斯亮蓝法及茜素红染色法测定其生物学活性。结果 :PDLCs和ABCs在碱性磷酸酶活性 (ALP)及矿化结节形成方面与GFs有显著性差异。结论 :尽管三种细胞具有相同的镜下表现 ,但生物学特性不同 ,则具有不同的表型 ,从而在牙周再生中发挥着不同的作用。     

Ⅱ.纤维结合蛋白对牙槽骨细胞增殖与分化的影响

目的 :观察纤维结合蛋白 (FN)对人牙槽骨细胞增殖与分化的影响。方法 :采用细胞培养、MTT比色测定法、碱性磷酸酶 (ALP)测定法、考马斯亮蓝法和茜素红染色法。结果 :FN能促进牙槽骨细胞的增殖 ,对碱性磷酸酶活性和蛋白合成也有促进作用 ,但对矿化结节形成能力无显著影响。结论 :FN能促进牙槽骨细胞的增殖及蛋白合成 ,但促进细胞分化的能力有限 ,尚需其他生长因子的协助以促进组织再生。     

rhBMP-2明胶微球的制备及对人牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性影响

目的: 观察重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)明胶微球(rhBMP-2-GMs)对人牙周膜细胞(PDLCs)增殖和碱性磷酸酶活性的影响. 方法: 体外培养人PDLCs,分别用不同浓度的rhBMP-2和rhBMP-2-GMs作用,用四唑盐比色实验(MTT)和酶动力学方法进行观察. 结果: rhBMP-2和rhBMP-2-GMs均可以明显促进人PDLCs增殖、提高碱性磷酸酶(ALP)活性,并呈剂量依赖性,rhBMP-2-GMs较单独应用rhBMP-2的效应更加显著. 结论: rhBMP-2-GMs利用其对rhBMP-2的缓释作用,对人PDLCs增殖和碱性磷酸酶活性的作用效果优于单独应用rhBMP-2.     

环孢素A联合脂多糖对牙周膜成纤维细胞生物学活性的影响

 目的 探讨环孢素A(CsA)联合牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)对人牙周膜成纤维细胞(PDLFs)生物学活性的影响。方法 将CsA（100 ng/mL）、LPS（100 ng/mL）分别单独及联合作用于人PDLFs,采用考马斯亮蓝染色、ELISA、Von kossa染色等方法检测其对PDLFs总蛋白量、碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白2（BMP-2）及矿化结节形成的影响。 结果 CsA单独及与LPS联合应用可促进细胞总蛋白的合成,增加细胞ALP活性及BMP-2的表达,并促进细胞矿化结节的早期形成;LPS单独应用可增加细胞的ALP活性,但对细胞的总蛋白合成、BMP-2的表达及矿化结节的早期形成无明显影响。。结论 一定浓度的CsA促PDLFs合成、分化作用明显,CsA联合LPS在促进细胞分化方面具有一定的协同作用。     

正常人与慢性牙周炎患者牙槽骨组织培养细胞的生物学特性

目的比较正常人和慢性牙周炎患者的牙槽骨组织细胞系的生物学特性。方法原代培养牙周炎患者组(异常牙槽骨组)细胞系(H-171)和正常组细胞系(H-258和H-262),用组织化学、免疫组化等方法染色,观察细胞形态。用细胞计数法计算出2种细胞的倍增时间和分裂指数。结果异常牙槽骨组织原代培养一次成功,细胞形态为梭形。正常人牙槽骨组织原代细胞存活,生长速度较H-171慢。2组细胞均贴壁生长,具有成骨细胞的特点:碱性磷酸酶(AKP)染色、甲苯胺蓝、藩红花O、四环素标记矿化结节组织化学染色、过碘酸雪夫(PAS)、Ⅰ型胶原、BMP-2免疫组织化学染色均为阳性。结论2组细胞均具有成骨细胞特点。生长速度H-171较H-258、H-262快。     

体外培养人牙髓细胞的生物学特征

为研究牙髓细胞的生物学特性 ,采用组织块原代培养方法体外培养人牙髓组织。原代培养组织块在接种后 7～ 1 0d开始长出细胞 ,培养约 30d ,细胞形成单层汇合后进行传代培养。传代至第 5代测定细胞生物学特征及来源。结果 :培养人牙髓细胞呈成纤维样 ,抗波形丝蛋白染色阳性 ;细胞内碱性磷酸酶 (ALP)阳性 ,细胞内ALP总活性随培养天数的增加逐渐增高 ;细胞Ⅰ型胶原、FN染色阳性 ;第 5代细胞培养至第 1 1天发现细胞生长成结节状 ,分泌网形胶原样物质 ,在其表面出现结晶样钙化小点 ,经VonKossa染色 ,呈阳性。实验证明 ,体外培养的人牙髓细胞为来源中胚层的成纤维样细胞 ,可分泌ALP、Ⅰ型胶原及FN ,在体外可发生矿化 ,是深入探讨牙髓生理及矿化机制的良好的实验材料     

晚期氧化蛋白产物对大鼠牙槽骨细胞凋亡的影响

目的 探讨晚期氧化蛋白产物(AOPP)对大鼠牙槽骨细胞凋亡的诱导作用.方法 选取大鼠牙槽骨细胞作为靶细胞,用不同浓度(0、100、200 μg/mL)的AOPP作用不同时间(12、24 h)刺激牙槽骨细胞,通过流式细胞仪测定细胞凋亡情况,酶标仪测定刺激下牙槽骨细胞活性氧(ROS)的生成量,采用免疫印迹法检测影响细胞凋亡的相关蛋白Bcl-2和Bax的表达变化.结果 原代培养获得的牙槽骨细胞呈贴壁生长,能合成碱性磷酸酶,具有成骨样细胞表现.AOPP可以引起牙槽骨细胞产生大量ROS,引起细胞凋亡,随着作用剂量的增大和作用时间的延长,细胞凋亡率明显升高,其中当AOPP作用浓度为200 μg/mL、作用时间为24 h时,凋亡率最高.牙槽骨细胞可表现为Bcl-2合成减少,Bax合成增加,而且相关凋亡因子表达随着作用时间的延长和作用浓度的增加而显著升高(P<0.05).结论 氧化应激可引起牙槽骨细胞凋亡,这可能是导致部分口腔慢性炎症性疾病后期出现牙槽骨吸收的原因.     

骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的研究骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响。方法将壳聚糖与海藻酸钠制成复合微球,包裹或不包裹骨形态发生蛋白。采用体外细胞培养技术,将两种微球分别与细胞一起培养,通过对细胞增殖率及碱性磷酸酶活性、考马斯亮蓝的检测,观察两种微球对培养细胞的影响。结果两种微球对骨髓基质细胞的增殖均无明显影响,但骨形态发生蛋白微球对细胞的分化及分泌功能有明显的促进作用。结论骨形态发生蛋白能够提高骨髓基质细胞的体外成骨能力,且壳聚糖海藻酸钠微球可作为骨形态发生蛋白的良好载体。     

骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 研究骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响。方法 将壳聚糖与海藻酸钠制成复合微球，包裹或不包裹骨形态发生蛋白。采用体外细胞培养技术，将两种微球分别与细胞一起培养，通过对细胞增殖率及碱性磷酸酶活性、考马斯亮蓝的检测，观察两种微球对培养细胞的影响。结果 两种微球对骨髓基质细胞的增殖均无明显影响，但骨形态发生蛋白微球对细胞的分化及分泌功能有明显的促进作用。结论骨形态发生蛋白能够提高骨髓基质细胞的体外成骨能力，且壳聚糖海藻酸钠微球可作为骨形态发生蛋白的良好载体。     

黄芩素对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

目的： 探讨中药黄芩提取物黄芩素对人牙周膜细胞（hPDLCs）增殖和成骨分化功能的影响。 方法：原代培养hPDLCs,向hPDLCs中分别加入浓度为0.3125、0.625、1.25 μmol/L的黄芩素作为实验组,对照组不加黄芩素。MTT法检测黄芩素对hPDLCs增殖的影响后,分别采用碱性磷酸酶（ALP）活性测定、茜素红S 染色、Real-time PCR和Western Blot法研究黄芩素对hPDLCs ALP活性、矿化结节形成、I型胶原（Col-I）mRNA和蛋白表达的影响。 结果： 与对照组相比,各浓度黄芩素对hPDLCs增殖均无明显影响;各浓度黄芩素组均表现为ALP活性上升;同时骨向诱导21 d后可见黄芩素组矿化结节形成增加,定量分析结果显示1.25 μmol/L黄芩素组形成矿化结节数量最多;Real-time PCR和Western Blot结果显示各浓度黄芩素组Col-ImRNA和蛋白表达均有上升,7 d时随浓度的增加其表达上升,1.25 μmol/L黄芩素组达到最高水平。     

大鼠成骨细胞与TCP/HA支架材料复合培养的实验研究

目的　为开展骨组织工程研究 ,建立成骨细胞与支架材料的体外复合培养模型。方法　取SD新生大鼠颅骨 ,组织块法培养成骨细胞 ,形态学结合免疫细胞化学鉴定其生物学特征 ,矿化液诱导后 ,茜素红染色显示钙结节形成 ;以磷酸三钙 /羟基磷灰石 (tricalcium phosphate/hydroxyapatite,TCP/HA)为支架 ,相差显微镜下观察纤粘连蛋白对细胞在支架材料上粘附的影响。结果　培养的成骨细胞呈短梭形或多角形 ,抗碱性磷酸酶单抗染色阳性 ;矿化液诱导后 2 0d茜素红染色 ,见红色着色的钙结节 ;纤粘连蛋白能促进成骨细胞在TCP/HA支架上的粘附。结论　本实验成功地建立体外成骨细胞培养方法 ,细胞外基质活性分子的加入能促进细胞与支架材料的粘附。     

松质骨成骨细胞的培养和鉴定

目的:探讨理想的人松质骨成骨细胞体外培养的方法。方法:取人髂骨松质骨,剪碎,用改良的酶消化法分离培养人成骨细胞;从细胞的形态学、增殖、碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色等方法鉴定培养的成骨细胞。结果:分离培养的人成骨细胞生长状态良好,纯度较高,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性。结论:改良的酶消化法分离培养松质骨可获得大量纯度较高的人成骨细胞。     

富血小板纤维蛋白凝胶析出液对人牙髓细胞体外矿化的影响

目的探索富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)凝胶析出液对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)体外矿化的影响。方法组织块法培养hDPCs。采用Choukroun一步离心法制备PRF凝胶。将新鲜制备的PRF凝胶浸泡于DMEM培养基中,于第7d取析出液。用PRF凝胶析出液孵育hDPCs 3d后更换矿化诱导液。采用茜素红染色和RT-PCR检测人牙髓细胞矿化的潜能。结果矿化诱导21d后,茜素红染色观察到实验组有少量钙结节生成,而对照组无钙结节生成;RT-PCR结果显示,实验组hDPCs碱性磷酸酶(ALP)的表达为对照组的1.5倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 PRF凝胶析出液可促进人牙髓细胞矿化。     

芹菜素对人牙髓间充质细胞增殖和成骨分化的影响

目的 探讨芹菜素对人牙髓间充质细胞(hDPSCs)增殖与成骨分化的影响.方法 CCK-8法检测不同浓度芹菜素对hDPSCs增殖的影响;碱性磷酸酶活性检测及碱性磷酸酶染色(ALP)和茜素红染色观察芹菜素对hDPSCs矿化能力的影响;Real-time PCR检测芹菜素影响下hDPSCs成骨向分化相关基因表达情况.构建兔颅骨缺损模型(4个直径8 mm圆形缺损),分四组:空白组、骨粉组、普通培养的hDP-SCs复合骨粉组、含5μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组.术后4、8周取标本行Micro-CT测量骨体积分数.结果 CCK-8检测显示5μmol/L芹菜素对hDPSCs增殖影响最优;茜素红染色结果显示5 μmol/L芹菜素组钙结节的数量明显增多,碱性磷酸酶活性显著提高(P＜0.001);PCR结果显示5 μmol/L芹菜素组RUNX2和OCN表达上调.Mi-cro-CT显示在4、8周含5μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组的新骨形成较普通培养的hDPSCs复合骨粉组多,空白组与骨粉组成骨效果不明显.结论 芹菜素能促进hDPSCs的增殖和成骨分化,为临床治疗牙周骨缺损提供新思路.     

鹿茸多肽纳米复合材料诱导兔骨髓间质细胞向成骨细胞的分化效应

目的：探讨鹿茸多肽纳米复合材料诱导兔骨髓间质细胞（MSCs）向成骨细胞分化的效应,阐明复合材料作用机制。方法：将含5 mg/g鹿茸多肽、20%纳米β-磷酸三钙（β-TCP）和明胶的复合材料（以下简称复合材料）与第3代MSCs共培养 48 h,用MTT法和流式细胞术检测复合材料对MSCs增殖及细胞周期的影响;AO/EB荧光染色观察MSCs凋亡形态的变化;将MSCs与复合材料共培养,扫描电镜下观察细胞黏附、生长情况;复合材料连续作用于MSCs 21 d,全自动生化分析仪检测细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色法观察复合材料对MSCs矿化结节形成的作用。结果：复合材料作用于MSCs 48 h,可明显促进MSCs增殖,相对增殖率为126.45%,此时的MSCs主要处于S期,占细胞总数45.84%（对照组为7.96%）,凋亡率为2.08%（对照组为13.68%）;MSCs在复合材料上黏附、生长良好,呈多角或梭形。复合材料连续作用MSCs 21 d,显著增加了矿化结节形成;随着作用时间的延长,细胞的ALP活性也逐渐增强,21  d 复合材料组与对照组比较明显升高（P<0.001）。结论：复合材料在体外可促进MSCs增殖,并可诱导MSCs向成骨细胞分化,具有良好的成骨效能。     

体外培养的人牙囊细胞矿化相关标志物的表达

目的体外培养人牙囊细胞，探讨牙囊细胞是否具成骨、成牙骨质细胞表型特征，是否呵作为牙骨质再生的种子细胞。方法酶消化联合组织块法获得人牙囊细胞，免疫酶细胞化学染色技术检测其Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的表达．RT-PCR技术检测细胞的骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶的表达。矿化诱导并连续培养牙囊细胞，行Von kossa染色检测体外矿化形成情况。结果免疫组化结果：牙囊细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白呈不同程度的阳性表达：RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。经矿化诱导后的牙囊细胞在20d时可形成矿化结节，von Kossa染色阳性。结论牙囊细胞具有成骨细胞、成牙骨质细胞的部分特性，体外培养的人牙囊细胞具有分泌合成矿化组织的能力，可试将其作为牙周组织再生的种子细胞。     

bFGF-PLA-Ns对体外培养成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

目的观察制备的碱性成纤维生长因子聚乳酸纳米微球缓释系统(bFGF-PLA-Ns)对体外培养的兔成骨细胞的增殖、分化和矿化能力的影响。方法体外培养兔成骨细胞并鉴定,将bFGF-PLA-Ns和第4代成骨细胞一起培养,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞ALP活性,茜素红染色方法观察矿化结节的形成,并与单纯bFGF和空白组的作用进行比较。结果bFGF-PLA-Ns具有良好的生物活性,能显著促进兔成骨细胞的分化和矿化,其效应高于单纯施加bFGF和空白组的效应。结论制备的bFGF-PLA-Ns比单纯的bFGF对体外培养的成骨细胞有更为显著的生物学效应,在骨创伤的治疗中有良好的前景。     

人重组转化生长因子β1促进牙髓干细胞的增殖和矿化

目的：研究人重组转化生长因子β1（recombinant human transforming growth factor β1, rhTGF-β1）对牙髓干细胞生物学性能的影响,包括确定促进牙髓干细胞增殖的最佳作用浓度和该浓度下对牙髓干细胞分化的作用。方法： 分离培养人健康第三磨牙牙髓干细胞,分别加入1 μg/L、6 μg/L、10 μg/L的rhTGF-β1,CCK 8（cell counting kit-8）法检测对牙髓干细胞增殖的影响,选择出最佳浓度在成骨/成牙本质诱导条件下连续培养,酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）光密度值,二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白质定量试剂盒计算总蛋白含量,两者比值作为ALP相对活性的指标。茜素红染色观察矿化结节形成能力,染色液洗脱后检测光密度值,比较rhTGF-β1对牙髓干细胞增殖和分化的作用。结果：牙髓干细胞具有体外形成矿化结节的能力,6 μg/L rhTGF-β1可促进牙髓干细胞增殖;连续培养7 d后,6 μg/L rhTGF-β1组细胞ALP的光密度值为0.31±0.03,显著高于对照组0.02±0.01(P<0.05);6 μg/L rhTGF-β1组总蛋白含量为（2 775.46±83.54） mg/L,对照组为（1 432.20±110.83） mg/L (P<0.05);ALP相对光密度值,6 μg/L rhTGF-β1组较对照组提高了6倍。茜素红染色下显示矿化结节形成增加,洗脱液光密度值6 μg/L rhTGF-β1组和对照组分别为0.83±0.02和0.55±0.05, P<0.05。结论： 6 μg/L rhTGF-β1具有促进牙髓干细胞增殖和促进体外成牙本质分化的作用。     

体外培养的人牙囊细胞矿化相关标志物的表达

目的 体外培养人牙囊细胞,探讨牙囊细胞是否具成骨、成牙骨质细胞表型特征,是否可作为牙骨质再生的种子细胞。方法 酶消化联合组织块法获得人牙囊细胞,免疫酶细胞化学染色技术检测其Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的表达,RT-PCR技术检测细胞的骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶的表达。矿化诱导并连续培养牙囊细胞,行Von kossa染色检测体外矿化形成情况。结果 免疫组化结果:牙囊细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白呈不同程度的阳性表达;RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。经矿化诱导后的牙囊细胞在20d时可形成矿化结节,von Kossa染色阳性。结论 牙囊细胞具有成骨细胞、成牙骨质细胞的部分特性,体外培养的人牙囊细胞具有分泌合成矿化组织的能力,可试将其作为牙周组织再生的种子细胞。     

大黄素通过BMP-9途径促进前体成骨细胞的分化

目的 研究大黄素对前体成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的影响及其作用机制。方法 采用不同浓度（0.05、0.1、0.5、2.0和5.0 μmol/L）大黄素处理MC3T3-E1细胞（给药组）,以不加大黄素为对照组。分别采用MTT法检测细胞的增殖率;对硝基苯基磷酸二钠（PNPP）法定量检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化结节数目;RT-PCR法检测骨形态发生蛋白（BMPs）途径相关信号分子的表达。采用BMPs抑制剂（Noggin）处理细胞后检测ALP活性,观察BMP-9在大黄素促成骨分化中的作用。结果 大黄素对MC3T3-E1细胞的增殖无影响,大黄素浓度为0.5~5.0 μmol/L时可促进细胞ALP表达及矿化结节形成,其中浓度为5 μmol/L时效果最显著。大黄素可增强细胞BMP-9的表达,与BMP-9信号途径相关的上下游信号分子mRNA的表达亦有相应改变;Noggin预处理后,大黄素促成骨分化的功能受到明显抑制。结论 大黄素可通过激活BMP-9信号通路促进前体成骨细胞的分化。