桃红四物汤促进自噬抑制氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨桃红四物汤(TST)对氧糖剥夺(OGD)诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用。 方法 将H9C2心肌细胞分为5组(n=3)：对照组、OGD模型组、OGD +TST含药血清处理组、OGD +TST含药血清+雷帕霉素处理组、OGD +TST含药血清+氯奎处理组。四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫印迹法(western blot)检测自噬相关蛋白(LC3、p62)和凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)的表达。结果 与对照组相比,OGD模型组细胞活力显著下降(P<0.05),细胞凋亡显著增多(P<0.05),LC3II/LC3I比值和促凋亡蛋白Bax显著增多,p62和抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。与OGD模型组相比,OGD +TST含药血清处理组的细胞活力显著升高(P<0.05),细胞凋亡明显减少(P<0.05),LC3II/LC3I比值、Bcl-2表达增多,p62和Bax蛋白表达减少。与OGD +TST含药血清处理组相比,OGD +TST含药血清+雷帕霉素处理组的细胞活力进一步升高(P<0.05),细胞凋亡比例进一步减少(P<0.05),LC3II/LC3I比值、Bcl-2表达进一步增多,p62和Bax蛋白表达进一步减少;而氯奎处理桃红四物汤治疗组的细胞活力下降(P<0.05),凋亡细胞比例升高(P<0.05),LC3II/LC3I比值、Bcl-2表达减少,p62和Bax蛋白表达增多。结论 桃红四物汤促进氧糖剥夺H9C2心肌细胞自噬,抑制心肌细胞凋亡,对心肌缺血起保护作用。     

不同浓度百草枯对人支气管上皮细胞自噬的影响

目的研究不同浓度百草枯(PQ)对人支气管上皮细胞(16HBE)自噬的影响。方法不同浓度(50μM,150μM,500μM)的百草枯作用16HBE,分别在0 h、12 h、24 h通过Western Blot检测细胞中LC3-Ⅱ蛋白、LC3-I蛋白及P62蛋白的表达,电镜观察染毒组及对照组自噬小体变化。结果在实验中,PQ染毒组观察到细胞质中出现广泛大量自噬小体,相较对照组,自噬小体明显增多。50μMPQ染毒组Western Blot检测LC3-II/LC3-I蛋白浓度24 h组最高,12 h组次之,对照组表达水平最低(P<0.05),P62蛋白浓度24 h最低,12 h次之,对照组表达水平最高(P<0.05)。150μMPQ染毒组Western Blot检测LC3-II/LC3-I蛋白浓度各干预组与对照组相比无明显统计学意义,P62蛋白浓度各干预组与对照组相比统计学意义(P>0.05)。500μMPQ染毒组Western Blot检测LC3-II/LC3-I蛋白浓度各干预组与对照组相比无明显统计学意义(P>0.05),P62蛋白浓度各干预组与对照组相比无统计学意义... 更多     

血管性痴呆大鼠海马CA1区自噬及微管相关蛋白1轻链3的表达

目的 观察血管性痴呆(vascular dementia,VD)模型大鼠海马CA1区自噬及微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3,LC3)的表达,探讨自噬在血管性痴呆发病中的可能作用。方法 大鼠随机分为假手术组(sham组)、血管性痴呆模型组(VD组)和Wortmannin自噬抑制剂组(WM组),每组又随机分为模型制备后1、2、4、8、12周5个亚组。采用四血管阻断法制作血管性痴呆模型,Morris水迷宫法检测学习记忆能力,透射电镜观察自噬体的形成,蛋白质印迹法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 的比值作为自噬活性的指标。结果 与假手术组相比,VD组大鼠平均逃避潜伏期延长(P<0.05或0.01),穿越平台次数减少(P<0.05或0.01);与VD组比较,WM组大鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05或0.01),穿越平台次数增加(P<0.05或0.01)。VD组大鼠海马CA1区1周时神经细胞核膜凹陷,胞核浓缩,线粒体肿胀,可见自噬体、溶酶体;4周时自噬体、溶酶体数量显著增多;12周时仍可见自噬体。WM组神经元损伤较VD组减轻,自噬体数量减少。VD组大鼠海马CA1区LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在1周时升高,4周时达到高峰,8周时开始下降,12周时仍较高。WM组各时间点LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较VD组低,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。结论 血管性痴呆大鼠海马CA1区自噬活性被激活,可能参与了血管性痴呆的发生发展。     

姜黄素诱导人肝癌细胞系Huh7自噬和凋亡

目的 探讨姜黄素诱导人肝癌细胞Huh7自噬和凋亡的作用,以及抑制自噬对姜黄素诱导凋亡的影响。方法 将姜黄素（5、10、20、40 μmol/L）加入人肝癌细胞系Huh7的培养液中,用CCK-8检测细胞增殖水平变化。Huh7细胞用5~40 μmol/L姜黄素培养48 h,通过蛋白质印迹法检测自噬微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值,免疫荧光法检测自噬小体的形成,评估Huh7细胞自噬水平的变化。通过流式细胞术检测Huh7细胞凋亡情况。加入5 mmol/L自噬抑制剂3-甲基嘌呤（3-MA）和20 μmol/L姜黄素培养Huh7细胞,检测Huh7细胞凋亡水平和自噬水平的变化。结果 CCK-8检测显示姜黄素能抑制Huh7细胞的增殖（P<0.05,P<0.01）,且细胞凋亡率随着姜黄素浓度的升高而上升;蛋白质印迹检测显示加入姜黄素后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值上升（P<0.05,P<0.01）,免疫荧光检测显示加入20 μmol/L姜黄素后自噬小体增多。与单独使用20 μmol/L姜黄素培养的Huh7细胞相比,姜黄素联用3-MA培养的Huh7细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值下降（P<0.01）,自噬小体减少。流式细胞术检测发现5~40 μmol/L姜黄素促进了Huh7细胞凋亡（P<0.05,P<0.01）,而联用3-MA后与单独使用20 μmol/L姜黄素培养相比引起的Huh7细胞凋亡减少（P<0.05）。结论 姜黄素能诱导Huh7细胞凋亡、抑制细胞增殖并促进细胞自噬,抑制自噬能减弱姜黄素对Huh7细胞的诱导凋亡效应。     

丹酚酸B介导AMPK活化加剧氧化应激诱导的甲状腺癌细胞凋亡和自噬

【摘要】 目的 探讨丹酚酸B对氧化应激诱导的甲状腺癌细胞凋亡和自噬的影响。 方法 选择不同浓度的丹酚酸B处理甲状腺癌TPC-1和甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1细胞,24 h后CCK8检测细胞存活率;选择无显著毒性的剂量 (2.5、5、10 μg/mL) 进行后续实验,流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）水平和细胞凋亡;蛋白印迹法检测细胞内和线粒体内细胞色素C以及凋亡、自噬相关蛋白的表达水平;免疫荧光检测LC3的水平;此外,在细胞中加入腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抑制剂Compound C (50 nM) 后,将细胞随机分为对照组、丹酚酸B 10 μg/mL组、Compound C组、Compound C+丹酚酸B 10μg/mL组,〖JP2〗流式细胞术检测细胞内ROS水平和细胞凋亡;蛋白印迹法检测AMPK相关蛋白和自噬相关蛋白的表达。结果 TPC-1 和Nthy-ori 3-1细胞的存活率以丹酚酸B浓度依赖的方式降低,丹酚酸B浓度超过20 μg/mL时,TPC-1细胞的存活率显著降低（P＜0.05）;当丹酚酸B浓度超过40 μg/mL时,Nthy-ori 3-1细胞的存活率显著降低（P＜0.05）。与对照组相比,经5、10 μg/mL丹酚酸B预处理后,TPC-1细胞内的ROS水平、凋亡率、Bax、Cleaved caspase 3、Beclin1和细胞质中Cyto C的蛋白表达水平、LC3的水平、AMPK磷酸化水平、LC3 II/LC3-I 的比值均显著升高（P＜0.05）;Bcl-2、P62和线粒体中Cyto-C的蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。与对照组相比,丹酚酸B 10 μg/mL组AMPK磷酸化水平、LC3 II/LC3 I比值、ROS水平、细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）;Compound C组AMPK磷酸化水平,LC3-II/LC3-I比值、ROS水平、细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）。与Compound C组比较,Compound C+丹酚酸B 10 μg/mL组AMPK磷酸化水平、LC3-II/LC3-I 的比值、ROS水平、细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）。结论 5、 10 μg/mL的丹酚酸B可通过介导的AMPK活化加剧氧化应激诱导的甲状腺癌细胞的凋亡和自噬,以10 μg/mL的丹酚酸B效果最佳。     

抑制自噬对根尖乳头干细胞成骨分化水平的影响

目的探讨抑制自噬对根尖乳头干细胞成骨分化水平的影响。方法5、10 ng/mL 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分别处理根尖 乳头干细胞（SCAPs）,对照组不做处理,检测自噬相关蛋白LC3-II表达水平,GFP-LC3质粒转染并检测细胞内GFP-LC3数目, 吖啶橙染色检测酸性囊泡情况。TNF-α,TNF-α+3-MA分别处理SCAPs,检测LC3-II 的表达水平,GFP-LC3 质粒转染并检测 GFP-LC3数目,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡。TNF-α、TNF-α+3-MA分别处理SCAPs,对照组不做处理, 诱导成骨向分化,qRT-PCR检测分化第3、7、14天时成骨相关基因碱性磷酸酶（ALP）、骨涎蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）的表达。 结果TNF-α可诱导SCAPs自噬活化：TNF-α组LC3-II/β-actin水平较对照组升高且具有浓度依赖性（P<0.05）,TNF-α组GFP-LC3 数目较对照组升高且具有浓度依赖性（P<0.05）,TNF-α组酸性囊泡较对照组增多。3-MA可抑制TNF-α诱导的SCAPs自噬活 化：TNF-α+3-MA组LC3-II/β-actin水平及细胞内GFP-LC3数目较TNF-α组显著降低（P<0.05）,并下调细胞活力（P<0.05）,上调 细胞凋亡水平（P<0.05）。抑制自噬导致SCAPs成骨分化的抑制：TNF-α+3-MA组ALP、BSP表达量在分化第3、7、14 天均较 TNF-α组降低（P<0.05）,OCN的表达量在第3、7天较TNF-α组降低（P<0.05）。结论TNF-α可诱导SCAPs自噬水平的活化;自噬 可能对TNF-α作用下的SCAPs起细胞保护作用,对抗细胞凋亡;自噬的抑制将下调TNF-α作用下SCAPs的成骨向分化水平,提 示自噬在TNF-α作用下SCAPs的成骨分化过程中具有重要作用。     

Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

目的：探讨Tob1对肾上腺皮质癌细胞自噬的作用及其影响。方法：将体外培养的SW-13细胞分为对照组、空载质粒转染组以及pcDNA3.1-Tob1质粒转染组。实时荧光定量PCR检测各组细胞中Tob1的mRNA表达。Western blot检测Tob1以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin 1的表达。LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。随后在转染pcDNA3.1-Tob1质粒的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理,CCK-8检测细胞增殖,Tunel检测细胞凋亡。结果：pcDNA3.1-Tob1质粒转染显著上调SW-13细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达,提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1水平,降低p62蛋白表达,并显著提升细胞自噬水平(P<0.05)。与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组SW-13细胞增殖降低,细胞凋亡增加;与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖提升,细胞凋亡降低(P<0.05)。结论：Tob1能够通过激活细胞自噬降低人皮质癌细胞SW-13增殖并促进其凋亡。     

肿瘤相关巨噬细胞通过诱导肝癌细胞自噬降低索拉菲尼的促凋亡作用

目的探讨索拉菲尼治疗肝癌耐药的分子机制,寻找逆转耐药新靶点。方法体外诱导THP-1细胞建立M2型肿瘤相关巨 噬细胞（TAMs）,免疫荧光鉴定M2型TAMs,将SMMC-7721细胞分为空白对照组、M2-TAMs共培养组、索拉菲尼组以及索拉菲 尼与M2-TAMs共培养联合处理组,CCK-8法检测M2-TAMs对索拉菲尼抑制SMMC-7721增殖的影响;Annexin V/PI双染法、 蛋白质免疫印迹法检测使用自噬抑制剂氯喹处理前后M2-TAMs对索拉菲尼促SMMC-7721细胞增殖、细胞凋亡的影响及细胞 凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白的表达量变化。结果索拉菲尼对肝癌细胞SMMC-7721作用48 h的IC50为2.25 μmol/L,索拉菲 尼对与M2-TAMs共培养（共培养给药组）48 h 的SMMC-7721的IC50为4.72 μmol/L。共培养给药组与单独给药组相比细胞凋亡 率明显下降（P<0.01）,Bcl-2 表达明显增加,Bcl-2/Bax 比值增加（P<0.05）,而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高（P< 0.001）,p62蛋白表达下调（P<0.05）,自噬水平明显增强。氯喹处理后能明显抑制共培养给药组的细胞增殖（P<0.05）,促进细胞 凋亡（P<0.05）,下调Bcl-2/Bax比值（P<0.01）。结论M2-TAMs可通过促进SMMC-7721细胞自噬,降低索拉菲尼对肝癌细胞的 增殖抑制作用,因此抑制自噬可能是逆转肿瘤微环境诱导索拉菲尼治疗耐药的新靶点。     

二氢杨梅素调控自噬抑制氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究

目的观察二氢杨梅素（DMY）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响,并探讨自噬在其中的作用。方法DMY（0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L）预处理HUVECs 2 h,用100.0 mg/L ox-LDL 继续培养细胞24 h。以辛伐他汀作为阳性对照组。采用噻唑蓝法检测细胞活力,Hoechst33258染色观察细胞核形态,透射电镜观察自噬体,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Beclin-1和p62/SQSTM1的表达,观察自噬抑制剂对DMY作用的影响。结果与对照组比较,ox-LDL组细胞的存活率降低（p <0.05）,细胞核呈集中高强度蓝色荧光,固缩致密浓染或碎块状致密浓染,颜色发白,细胞核较小,形态不规则,自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62的表达下调（p <0.05）。与ox-LDL组比较,0.1、1.0和10.0μmol/L DMY预处理组细胞存活率均升高;细胞核荧光强度降低,核固缩致密浓染和碎块状致密浓染减少,形态较规则;1.0 μmol/L DMY 预处理组的自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62 的表达下调（p <0.05）。自噬抑制剂3-MA 部分抵消DMY 抑制ox-LDL诱导的HUVECs 存活率降低（p <0.05）。结论DMY 能抑制ox-LDL诱导的HUVECs 损伤,其机制与诱导自噬有关。     

黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡

目的研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组。除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理。用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P0.05)。与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P0.05)。结论黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。     

缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注自噬的影响

目的观察缺血预处理后不同间隔时间对大鼠脑缺血再灌注海马自噬的影响。方法参照ZeaLonga线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,将实验动物随机分为3组:假手术组(Sham组,n=10)、缺血再灌注组(I/R组,n=10)、缺血预处理组(IPC组,n=30),缺血预处理组再按缺血预处理后不同间隔时间分为1 d、3 d、5d 3个亚组,每组10只。缺血2 h再灌注24 h后用免疫组织化学法检测自噬相关蛋白BECLIN I、LC3-II的表达情况,透射电镜观察神经细胞中自噬和溶酶体的激活以及细胞超微结构的变化。结果(1)神经功能障碍评分:与Sham组比较,I/R组及IPC组均出现不同程度神经功能障碍(P<0.01),IPC组症状评分低于I/R组(P<0.05)。(2)脑梗死体积:与Sham组比较,I/R组及IPC组均有不同程度梗死灶(P<0.01);IPC组脑梗死灶体积明显低于I/R组(P<0.01),3 d亚组梗死体积少于1 d、5 d亚组(P<0.01)。(3)免疫组织化学染色:与Sham组比较,I/R组及IPC组BECLIN 1及LC3-II阳性表达增多(P<0.01),IPC组阳性表达显著低于I/R组(P<0.01),IPC 3 d亚组阳性表达低于1 d、5 d亚组(P<0.01)。(4)脑组织超微病理形态改变:Sham组细胞正常;I/R组及IPC组可见数量不等、处于不同时期的自噬体和或自噬溶酶体,线粒体肿胀,膜破裂,可见空泡,各级溶酶体显著增多,可见变形次级溶酶体,高尔基体分裂;IPC组自噬体及各级溶酶体数量较I/R组减少,各IPC亚组间自噬体及各级溶酶体数量无可见变化。结论缺血预处理可能通过下调自噬水平减轻缺血再灌注损伤,缺血预处理3 d优于1 d、5 d。     

褪黑素可改善PBDE-47所致PC12细胞的异常自噬与凋亡

目的 探讨褪黑素（MT）对2,2',4,4'-四溴联苯醚（PBDE-47）所致大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞异常自噬与凋亡的影响。方法 通过一系列浓度梯度 MT（12.5、25、50、100、200 μmol/L）预处理 PC12 细胞 2 h 后,并联合浓度为 20 μmol/L的PBDE-47染毒细胞24 h,采用细胞计数试剂盒（CCK8）检测细胞存活率,筛选25 μmol/L MT用于后续实验。实验分组为：溶剂对照组（0.5‰ DMSO）、20 μmol/L PBDE-47处理组、20 μmol/L PBDE-47+25 μmol/L MT处理组、25 μmol/L MT处理组。采用免疫荧光技术检测自噬体标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）阳性着色情况;采用Western blot技术检测自噬关键蛋白自噬相关蛋白7（ATG7）、自噬选择性底物p62、LC3-II水平,以及凋亡相关蛋白活化型含半胱氨酸的天冬氨酸-3（active caspase-3）和剪切型多（ADP-核糖）聚合酶（cleaved PARP）水平。结果 CCK8结果表明,PBDE-47处理组细胞活力相比对照组有所下降（P=0.001）;与PBDE-47处理组相比,PBDE-47+25 μmol/L MT处理组细胞存活率上升且在80%以上,差异均有统计学意义（P=0.023）。与对照组相比,PBDE-47处理后PC12细胞LC3蛋白阳性着色增强;此外,PBDE-47处理组PC12细胞ATG7蛋白水平下降,p62、LC3-II、active caspase-3、cleaved PARP蛋白水平上升,差异均有统计学意义（P 均<0.001）。与PBDE-47处理组相比,PBDE-47+MT处理组LC3蛋白阳性着色减弱;此外,PBDE-47+MT处理组ATG7蛋白水平上升（P=0.034）,p62蛋白水平下降（P=0.048）,LC3-II蛋白水平下降（P=0.018）,active caspase-3蛋白水平下降（P<0.001）,cleaved PARP蛋白水平下降（P=0.032）。结论 PBDE-47可通过诱导PC12细胞自噬损伤引起自噬体蓄积,并能促进细胞凋亡,从而降低细胞存活;褪黑素可改善PBDE-47所致PC12细胞异常自噬与凋亡,进而提高细胞存活。     

参元丹含药血清对心肌缺血保护作用及其微管相关蛋白及自噬相关基因表达的影响

目的：通过参元丹胶囊含药血清对心肌细胞活性、培养液上清乳酸脱氢酶（LDH）活性、LC3微管相关蛋白LC3及自噬相关基因Beclin1-mRNA表达影响的研究,探讨参元丹胶囊对心肌缺血保护作用及作用机制。方法：分离1～3天龄Wistar大鼠心肌细胞进行细胞培养,采用无血清无糖培养建立心肌缺血细胞模型,于不同时间点加入参元丹胶囊含药血清,采用MTT法、比色法、蛋白免疫印迹技术（Western Blot）及逆转录PCR（RT-PCR）测定细胞活性、上清培养LDH含量、微管相关蛋白LC3蛋白（LC3I及LC3II）表达及哺乳动物自噬相关基因Beclin1-mRNA表达。结果：10%参元丹含药血清与相应时间点10%空白血清比较,能明显增加心肌缺血模型中3、6、18及24h心肌细胞活性（P〈0.01）、降低培养液上清LDH活性（P〈0.05）;通过计算LC3II/LC3I比值发现参元丹含药血清能明显抑制缺血诱导24h的细胞自噬活性（P〈0.05）,而对心肌缺血模型各个时间点Beclin1-mRNA的表达没有影响。结论：参元丹含药血清对心肌细胞缺血损伤有保护作用,并可以在心肌细胞缺血较长时间后抑制自噬的活性,但其对自噬活性的影响可能与Beclin1表达无关。     

多种细胞自噬调节剂对自噬标记物LC3II及p62表达的影响

利用Western杂交检测自噬标记物LC3II和p62的表达是评价细胞自噬活性的常用方法。为了比较作用于不同靶点的细胞自噬调节剂对LC3II和p62表达的影响,分别利用以mTOR依赖或非依赖方式活化细胞自噬的雷帕霉素或海藻糖、抑制自噬起始的3-甲基腺嘌呤、抑制自噬小体与溶酶体融合的巴弗洛霉素A1以及抑制溶酶体酶活性的E64d和pepstatin A处理HEK293细胞,通过Western杂交检测LC3II和p62的表达。结果显示,雷帕霉素增强LC3I向LC3II转化,促进p62降解,而海藻糖仅引起LC3II表达的上调;阻断细胞自噬过程各个阶段均导致LC3II和p62堆积,并呈现出剂量和时间依赖性。这些结果提示尽管LC3II和p62均为自噬标记物,但不同的调节剂对其表达的调控存在差异。     

自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用

目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.     

自噬在塞来昔布对脑胶质瘤SHG-44细胞放射增敏效应中的作用

目的探讨自噬在塞来昔布对脑胶质瘤SHG-44细胞放射增敏中的作用。方法选择脑胶质瘤细胞株SHG-44作为实验对象,并分成对照组（C组）、塞来昔布组（D组）、辐射组（R组）和联合组（D＋R组）。集落形成法检测塞来昔布对SHG-44细胞的放射增敏作用。吖啶橙染色、FITC标记LC3-Ⅱ抗体和电镜共同检测细胞的自噬水平。流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡情况。结果塞来昔布（30μmol/L）增加SHG-44细胞的放射敏感性,诱导肿瘤细胞自噬和G2/M期阻滞。电镜观察发现塞来昔布、辐射及联合作用后胞质内可见自噬体,而无明显的核浓缩和核碎片。吖啶橙染色和FITC-MAP1-LC3-Ⅱ标记自噬体发现D＋R组细胞自噬水平明显高于R组（P〈0.05）。D＋R组G2/M期细胞比例为（34.26±2.20）%,R组为（29.15±1.99）%,D＋R组明显多于R组（P〈0.05）,而相应的凋亡比例分别为（9.7±1.24）%和（8.2±0.93）%,两组差异无统计学意义（P〉0.05）。随着辐射剂量的增加,细胞自噬水平增高,而细胞存活率呈指数性递减（决定指数R=0.98,P〈0.05）。结论塞来昔布增强辐射诱导SHG-44细胞G2/M期阻滞、促进细胞自噬、诱导细胞自噬性死亡,可能是其增加放射敏感性的机制之一。     

脓毒症相关性脑病大鼠海马区神经细胞自噬

目的：探讨脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)大鼠海马区神经细胞自噬现象及微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达。方法：盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture，CLP)建立脓毒症大鼠模型。60只30日龄健康雄性Wistar大鼠被随机分为假手术组(10只)和CLP组(50只)。CLP后12 h监测大鼠脑电图(electroencephalogram，EEG)及体感诱发电位(somatosensory evoked potential，SEP)，并进行神经生物学评分。根据大鼠是否发生SAE将CLP组大鼠再分为SAE(+)组和SAE(–)组。HE染色观察大鼠海马区病理学改变；电子显微镜观察大鼠海马区神经细胞自噬的超微结构；Western印迹检测LC3-I和LC3-II蛋白的表达。结果：50只大鼠在CLP后12 h内死亡5只，存活45只大鼠中有16只出现神经行为学、EEG及SEP改变，诊断为SAE，其发病率为35.56%(16/45)。与假手术组和SAE(–)组比较，SAE(+)组大鼠在CLP后12 h时α波的频率明显减少，δ波增加，P1振幅下降，P1波和N1波潜伏期延长(P<0.05)。CLP后12 h时SAE(+)组大鼠海马区细胞明显水肿，锥体细胞明显减少，甚至溶解，细胞排列紊乱，而假手术组和SAE(–)组大鼠海马区细胞形态正常、层次清楚。透射电子显微镜观察表明：SAE(+)组大鼠海马区细胞结构紊乱，可见自噬泡、颗粒状基质和方形或长方形晶体，自噬泡内含有溶酶体等细胞器，假手术组和SAE(–)组大鼠海马区组织细胞无自噬泡形成。SAE(+)组大鼠在CLP后12 h，海马区神经细胞LC3-II/LC3-I值明显高于假手术组和SAE(–)组(P<0.05)。结论：SAE大鼠海马区神经细胞存在细胞自噬现象，LC3-II/LC3-I值明显升高。     

氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠大脑皮层星形胶质细胞自噬的影响

目的观察氯胺酮对谷氨酸诱导的大鼠大脑皮层星形胶质细胞自噬的影响。方法取新生大鼠大脑皮层,原代混合培养、分离、纯化获得星形胶质细胞。实验分3个组：对照组（C组,加入D-Hank＇s液）;谷氨酸组（G组,加入谷氨酸至终浓度125μmol/L）;谷氨酸和氯胺酮组（GK组,先加入谷氨酸至终浓度125μmol/L,30 min后加入氯胺酮至终浓度1 mmol/L）。用相差显微镜观察细胞形态变化,免疫荧光染色鉴定细胞种类及LC3蛋白在细胞内的表达,通过Western blot法检测beclin-1、bcl-2、LC3蛋白的表达变化。结果 G组细胞内beclin-1、beclin-1/bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达较C组上升,bcl-2蛋白表达较C组下降（均P〈0.05）。GK组细胞内beclin-1、beclin-l/bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达较G组下降,bcl-2蛋白表达较G组上升（均P〈0.05）。结论 125μmol/L谷氨酸能促进星形胶质细胞发生自噬和凋亡,1 mmol/L氯胺酮可抑制谷氨酸诱导星形胶质细胞发生的自噬和凋亡。     

细胞自噬在三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究

【摘要】 目的 研究细胞自噬在三氧化二砷（ATO）诱导的肝癌细胞死亡中的作用,观察调控细胞自噬对ATO诱导的细胞凋亡有何影响。方法 以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在ATO作用于HepG2细胞的基础上,加入自噬激动剂〔雷帕霉素（Rap）〕和自噬抑制剂〔三甲基腺嘌呤（3-MA）〕进行调控。以MTT法检测细胞生存率,透射电镜观察自噬体结构,免疫印迹法分析自噬相关蛋白LC-3和Beclin1的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 5~20 μmol/L ATO与10 mmol/L 3-MA联用时HepG2细胞存活率比同剂量ATO单独作用时降低（P <0.05）,凋亡率增加（P <0.05）,细胞内呈现典型凋亡反应特征,自噬蛋白LC3和Beclin1表达低于ATO单独作用组（P <0.05）。相反,5~20 μmol/L ATO与0.25 μmol/L Rap联用时,HepG2细胞的存活率比ATO单独作用时显著增加（P <0.05）,凋亡率降低（P <0.05）,细胞内出现大量自噬体结构,自噬蛋白LC3和Beclin1的表达较ATO单独作用组有增加趋势,但差异无统计学意义（P >0.05）。结论 特异性自噬抑制剂能显著增强ATO杀伤肝癌细胞的敏感性,其机制与增强肝癌细胞凋亡有关。     

Beclin1基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用

目的 探讨Beclinl基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用.方法 采用RNA干扰技术抑制Beclinl表达,Beclinl被抑制后细胞的存活能力通过MTT实验评估;结直肠癌细胞SW620在血清剥夺状态下自噬活性通过LC3蛋白水平评估;分别经血清剥夺、星孢菌素及依托泊苷处理的SW620凋亡率通过流式细胞仪检测;Beclinl表达情况经Western blot评估.结果 pSUPER-Becl组细胞血清剥夺后存活能力显著降低(P＜0.05),在血清剥夺24 h后,空白对照组和pSUPER-non组抗凋亡能力比pSUPER-Becl组更强(P＜0.05),星孢菌素处理后,pSUPER-Becl组细胞凋亡最为显著(P＜0.05),用依托泊苷处理后得到相似的结果(P＜0.05);pSUPER-non组与空白对照组细胞中Beclinl的表达随血清剥夺时间的延长呈现上调趋势(P＜0.05),这与LC3的表达变化相一致;而pSUPER-Becl组LC3的表达显著减少(P＜0.05).结论 Beclin1是结直肠癌细胞中自噬和凋亡的关键调节因素,并且维持凋亡和自噬的平衡;Beclinl通过调节细胞自噬活性,在结直肠癌发展与演进中作为一种保护机制,使肿瘤细胞免受到低营养和化疗所致的损伤而持续生存.