骨髓间充质干细胞的体内示踪及其修复椎间盘退变的实验研究

目的: 探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)的标记与体内示踪方法,及其治疗椎间盘退变的可行性.方法:取兔MSCs行体外培养,并在体外纯化扩增,用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记后分别于1、3、5、7 d用MTT法检测细胞活性.将标记后的细胞植入退变的椎间盘内.分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化,免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化,用MR扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪.所得数据进行统计学处理.结果:MTT法结果显示,SPIO对MSCs的生物活性无影响,MSCs能被SPIO有效标记.运用MR扫描可观察到其在体内的分布,并发现干细胞向周边发生了迁徙.8周内实验组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量高于模型组,差异有统计学意义.结论:SPIO可有效地标记MSCs并行体内活体示踪,且不影响细胞活性,是理想的示踪剂.SPIO标记后的MSCs移植能增加髓核中细胞外基质的含量,从而延缓椎间盘退变.     

兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的:初步探讨骨髓间充质干细胞(BMMSCs)与纤维环(AF)细胞的共培养对细胞增殖及主要细胞外基质的影响,进一步确定BMMSCs移植对椎间盘退变的预防和治疗作用。方法:分别培养兔的BMMSCs与AF细胞,将两种细胞按1∶1的比例混匀,利用离心管培养技术培养3周后取材,大体观察并行HE染色;使用荧光染料Hoechst33258检测细胞增殖;通过实时荧光PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖含量进行测定。结果:在体外培养3周后,细胞团体积达到最大,涂片染色显示共培养组细胞致密,细胞增殖较对照组明显,实时荧光PCR检测结果显示Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达增强。结论:在离心管内三维培养条件下,BMMSCs与AF细胞共培养能够促进增殖,增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量。     

转基因髓核细胞移植对兔腰椎间盘退变的影响

目的：椎间盘退变是引起腰背痛的主要原因。将腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）介导的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1) 双基因体外联合转染兔椎间盘髓核细胞后,再移植于退变椎间盘内,观察椎间高度、II型胶原和蛋白多糖合成的变化,以探讨体外延缓或逆转椎间盘细胞退变的方法。方法 20只新西兰大白兔应用CT引导下的微创穿刺法建立兔椎间盘退变模型。以rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1体外转染培养的兔髓核细胞,再将其显微注射于退变椎间盘内作为细胞移植组;退变椎间盘内注入磷酸盐缓冲液（PBS）作为退变对照组;正常椎间盘作为空白对照组。分别于6、10、14周行X线和MRI检查观察椎间高度的变化及椎间盘信号的改变,Western-blot鉴定细胞因子CTGF和TIMP1在椎间盘内的表达,35S整合法测定兔髓核组织蛋白多糖合成率,RT-PCR检测II型胶原及蛋白多糖mRNA的表达。结果 MRI证实CT引导下经皮微创穿刺2周后椎间盘开始退变。与退变对照组相比,MRI显示细胞移植组椎间盘退变明显减轻,转基因兔髓核细胞移植可减缓椎间高度(DHI)下降的发生率,转基因细胞移植组较退变对照组相比,Ⅱ型胶原含量和蛋白多糖的生物合成明显增加,差别有统计学意义（P﹤0.05）。结论 经皮CT 引导下穿刺可成功建立兔椎间盘退变模型。转双基因CTGF和TIMP1 髓核细胞移植可有助于椎间高度的维持,促进椎间盘内蛋白多糖和II型胶原的生物合成,明显延缓椎间盘退变。     

兔ADSCs与NPCs共培养后再移植对椎间盘退变影响

目的探讨兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)与髓核细胞(NPCs)共同培养后再植入兔腰椎间盘对Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响。方法体外分别提取分离培养兔ADSCs与NPCs。诱导分化兔ADSCs向成骨、成脂方向分化,鉴定兔ADSCs。将兔ADSCs与NPCs共同培养,诱导兔ADSCs向NPCs方向分化。新西兰大白兔30只,分为实验组和对照组,分别将兔ADSCs与NPCs共同培养后的细胞悬液、PBS缓冲液注入针刺抽吸后的椎间盘。4、8周后,采用间苯三酚分光光度法检测两组兔椎间盘髓核蛋白多糖表达的变化,采用反转录-聚合酶链反应对Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基因表达进行半定量分析。结果 ADSCs可诱导向成骨、成脂方向分化,与NPCs共同培养后由梭形、多角形变为成纤维细胞样。对照组髓核Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达低于实验组,差异有显著性(t=6.50～13.04,P<0.05)。结论兔脂肪组织可成功提取分离ADSCs,ADSCs与NPCs共同培养后移植可延缓兔椎间盘退变。     

骨髓间充质干细胞透明质酸钠溶液修复大鼠早期退变椎间盘的作用

目的研究无外源性生长因子及细胞支架的作用下，应用体外培养传代的骨髓间充质干细胞（bonemesenchymal stem cells，BMSCs）与透明质酸钠混合溶液修复大鼠早期退变椎间盘的作用。方法取同种基因大鼠的BMSCs，通过贴壁法培养传代，与医用透明质酸钠混合配制。10只SD大鼠，尾椎上取相邻3个椎间盘，由近端至远端设为细胞植入组、椎间盘退变组、正常对照组。分别于细胞植入组、椎间盘退变组建立退变模型。1周后，细胞植入组注射BMSCs与透明质酸钠溶液。3周后，X线片比较椎间盘高度指数（discheightin-dex，DHI），组织病理学方法行病理观测并评分，RT-PCR测定Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达。结果细胞植入组的DHI值与椎间盘退变组相比无明显改善且远低于对照组。病理切片结果提示植入组髓核纤维环的形态得到保留，髓核纤维环边界清晰，细胞产生增殖分裂，其病理学评分明显高于椎间盘退变组。RT-PCR结果提示细胞植入组Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达水平较椎间盘退变组明显提高。结论在椎间盘退变早期植入BMSCs与透明质酸溶液可以延缓椎间盘的退变，而不需要外源性细胞因子和三维支架的作用。     

骨髓间充质干细胞复合藻酸盐凝胶支架修复兔退变椎间盘的效果

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)复合藻酸盐凝胶支架修复兔退变椎间盘的效果。方法建立兔腰椎间盘退变模型,并将其分为对照组、空白组和治疗组。体外培养兔骨髓间充质干细胞,治疗组于椎间隙注射BMSC复合藻酸盐凝胶支架,对照组注射藻酸盐凝胶,空白组不予处理。应用MRI、免疫组织化学和生化分析的方法,观察椎间盘退变修复效果。结果术后2、4、8和12周,3组腰椎间盘均发生不同程度退变,术后12周治疗组的退变程度明显轻于对照组和空白组(P值均<0.05)。12周后,空白组、对照组及治疗组椎间盘髓核蛋白多糖的含量分别为(4.982±0.458)、(5.318±0.602)和(6.487±0.609)mg/100 mg组织,治疗组显著高于空白组和对照组(P值均<0.05);空白组、对照组及治疗组的椎间盘细胞外间质灰度值分别为150.669±2.387、149.849±2.481和141.680±1.618,治疗组Ⅱ型胶原含量显著高于对照组和空白组(P值均<0.05)。结论BMSC复合藻酸盐凝胶支架具有修复腰椎间盘退变的能力,可以做为修复椎间盘退变的生物学方法。     

组织蛋白酶D与兔椎间盘退变相关性研究

目的:采用椎间盘内注射不同浓度的组织蛋白酶D,探讨组织蛋白酶D在兔椎间盘退变中的作用.方法:健康大白兔60只随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组,实验组分为3个亚组,椎间盘内注射3种不同浓度的组织蛋白酶D,阴性对照组中在椎间盘内注射生理盐水,空白对照组不做任何处理.分别于术后3、6周,检测椎间盘髓核中蛋白多糖含量,采用HE染色组织学观察椎间盘的退变特征.结果:HE染色组织学观察6周时在实验组及阴性对照组椎间盘中,组织学观察到不同程度的椎间盘退变特征;蛋白多糖含量的测定显示,6周时各实验组蛋白多糖含量下降程度大于阴性对照组(P＜0.05).结论:组织蛋白酶D可导致兔腰椎间盘髓核内蛋白多糖含量的降低,说明组织蛋白酶D在椎间盘退变过程中可能起重要作用.     

BMSCs-Pluronic F-127水凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究

目的:探讨兔BMSCs-Pluronic F-127凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果,为临床应用提供实验依据。方法:6只1月龄健康新西兰白兔,雌雄不限,各取骨髓2 ml,分离培养BMSCs。取第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs),与Pluronic F-127水凝胶混匀,制备成BMSCs-Pluronic F-127水凝胶复合体。将18只新西兰大白免建立椎间盘髓核缺损退变动物模型,并随机分为3组(n=6)。正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理;移植治疗组将25μl BMSCs-Pluronic F-127水凝胶复合体注入缺损椎间盘中心;缺损退变组仅注射入0.01 mol.L-1PBS液25μl。8周后处死动物,取出脊柱,应用MRI测量各椎间盘的信号强度和邻近椎旁肌肉的信号强度,计算信噪比;取出相应椎间盘行阿尔辛蓝过碘雪夫(AB-PAS)染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,切片行灰度值测定和分光光度计测定蛋白多糖含量。结果:3组椎间盘信噪比差异有统计学意义(P<0.05)。AB-PAS染色显示,正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰;缺损退变组椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清...     

应用超顺磁性氧化铁纳米粒子标记神经干细胞及活体磁共振示踪的实验研究

目的 探索超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记神经干细胞体的方法及其检测手段,研究标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变。方法 分离培养新生鼠皮层神经干细胞,使用SPIO和多聚赖氨酸联合标记神经干细胞;将标记后的神经干细胞移植入Wistar大鼠脑内,应用不同的扫描序列对脑内移植的神经干细胞进行示踪。结果 体外标记的神经干细胞普鲁士蓝染色见细胞浆内有许多蓝染的铁颗粒,电镜检查表明SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内,标记后的细胞可正常分化。脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,以GREE序列信号改变最为明显。结论 超顺磁性氧化铁粒子可以用来标记神经干细胞,且对细胞增殖、分化无影响,SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内。标记后体内移植的神经干细胞可以在MR上产生明显的低信号改变。     

骨髓间充质干细胞修复兔椎间盘实验性研究

目的探讨骨髓间充质干细胞修复兔椎间盘损伤的效果。方法选取30只健康新西兰大白兔,随机分为观察组(n=15)和对照组(n=15)。2组兔均行椎间盘纤维环退行性变模型的建立。建模后观察组兔给予骨髓间充质干细胞与地塞米松磷酸钠的混合溶液进行治疗,对照组兔给予地塞米松磷酸钠进行治疗。对2组治疗后的椎间盘高度指数(DHI)、Ⅱ型胶原量及病理学情况进行比较。结果观察组兔在治疗后2、4、8、12周时的DHI和髓核组织的Ⅱ型胶原量与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组兔病理分级优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞在体外经过培养能够有效地对椎间盘纤维环进行修复。     

用胚胎干细胞诱导的造血干/祖细胞重建小鼠造血功能研究

目的 胚胎干细胞体外诱导分化出现CD34^ 造血干/祖细胞，然后将其注射入致死量照射小鼠体内，以研究其重建造血功能。方法 胚胎干细胞自由分化形成胚胎体后，加入造血刺激因子混合液以诱导产生CD34^ 造血干／祖细胞，将这些造血干／祖细胞注射入经致死剂量照射的小鼠，观察小鼠存活率的改变，并取存活2个月的小鼠骨髓和脾脏，PCR检测嵌合体形成。结果 体外分化第13日CD34^ 造血干／祖细胞比例可高达17．36％，将这些细胞注射入致死量照射小鼠后，可提高存活率达86．67％，存活小鼠的骨髓和脾脏均检测到供体来源的细胞。结论 胚胎干细胞体外分化获得CD34^ 造血干/祖细胞，且后者具有其相应的正常生物学功能。     

肝纤维化小鼠骨髓源性肝干细胞动员及确定

目的 建立小鼠四氯化碳性及酒精性肝纤维化模型并初步探讨干细胞动员情况,确定骨髓源性肝干细胞的表面标记.方法 四氯化碳皮下注射和酒精灌胃法使小鼠形成肝纤维化,分别取其骨髓干细胞,采用流式细胞仪检测肝纤雏化模型中不同干细胞标记的细胞群体包括c-kit Lin-,Thy1.2 Lin-,CD34 Lin-,Sca 1 Lin-的数量变化,寻找可能的肝干细胞动员情况.结果 与对照组相比,两组纤维化模型小鼠骨髓内c-kit Lin-细胞显著增高,其他干细胞类型细胞数量变化小.结论 c-kit Lin-细胞的数量在肝纤维化模型小鼠中存在明显动员情况,可能参与肝脏的修复,并成为肝干细胞的标记物.     

肝脏干细胞研究与应用存在的问题及对策

干细胞是目前生物医学的研究热点之一.近年研究发现肝脏中存在多种具有不同标志物的干细胞,在肝脏再生中具有重要作用;自体及异体干细胞移植治疗终末期肝病也取得了一定进展.但肝干细胞的来源及标志物尚未完全阐明,肝干细胞的增殖和分化调控机制仍有待深入研究.随着谱系追踪技术、干细胞分离和培养体系的发展与成熟,肝于细胞的来源及其在肝再生中的作用将会进一步明确,肝病干细胞治疗有望成为现实.     

全反式维甲酸促进多能干细胞向间充质干细胞样细胞分化

目的探索全反式维甲酸(RA)和SB431542对胚胎干细胞(ES)及诱导多能干细胞(i PS)分化为间充质干细胞(MSC)样细胞的影响。方法将培养的鼠ES和i PS根据不同的分化条件分为对照组、SB431542组及RA不同浓度组,对照组为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)完全培养基,SB431542组为DMEM完全培养基中含10μmol·L-1SB431542,RA不同浓度组的DMEM中分别含0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA。分化培养4 d后观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物CD105和干细胞抗原1(Sca-1)的表达,以CD105+细胞和Sca-1+细胞的比例确定i PS和ES向MSC分化的程度。结果小鼠ES和i PS在ESGRO-2i培养基里生长较好。ES分化4 d后,对照组和SB431542组ES和i PS分化成内皮样细胞,在含有不同浓度RA的培养基中ES和i PS可有效分化为纤维状细胞。ES分化4 d后,SB431542组Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),CD105+细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在RA 0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,ES分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组的CD105+和Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05)。i PS分化4 d后,SB431542组CD105+细胞和Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05)。0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,i PS分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较均显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05),0.20 nmol·L-1RA组CD105+细胞比例显著高于0.05、0.10 nmol·L-1RA组(P<0.05),但与0.40 nmol·L-1RA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用RA可以促进ES和i PS向MSC样细胞分化,分化方法较为简单,分化周期较短,为多能干细胞向MSC样细胞的分化提供了一定的方法基础。     

医学伦理视野中的人类干细胞来源问题

对两种不同来源的干细胞研究进行了伦理审视，认为组织干细胞研究所引发的伦理是非，其实质是稀缺卫生资源配置中的社会公平问题；胚胎干细胞研究过程中的人道危机，关键是胚胎的权利与地位问题，并指出适应生命科学的发展相关的伦理原则应重新定位。     

肝干细胞研究进展

肝干细胞是具有自我更新能力和分化为成熟肝细胞与胆管上皮细胞的双向分化潜能的原始细胞.肝干细胞不仅参与了肝脏的稳态维持、损伤修复和肝再生,而且在肝脏疾病的细胞治疗、人工生物肝及肝导向基因治疗中有着巨大的应用潜能.本文对几种主要类型的肝干细胞及它们的来源、分子标志物等进行了综述.     

低剂量辐射对小鼠外周血干/祖细胞的动员作用

目的:探讨低剂量辐射对小鼠外周血干/祖细胞的动员效应。 方法:采用深部X线对小鼠进行低剂量辐射,甲基纤维素半固体培养、流式细胞仪检测单纯低剂量辐射及联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)后外周血粒单系造血祖细胞集落（CFU-GM）及造血干祖细胞数量（c-kit⁺细胞数）。 结果:小鼠受到25～75 mGy照射后外周血CFU-GM集落数明显增多,c-kit⁺细胞数平行增加,其中以75 mGy组最明显;受照后24 h CFU-GM集落数开始增加,72 h最明显,96 h后有所下降。75 mGy+半量G-CSF组周围血CFU-GM集落数及c-kit值均明显高于单纯低剂量照射组,接近全量G-CSF组。 结论:低剂量辐射对小鼠外周血干/祖细胞有动员效应,联合应用G-CSF有明显的协同作用。     

干细胞蛋白质组学

由于干细胞具有多向分化潜能和自我更新能力,干细胞在再生医学领域有重要作用。蛋白质组学是大规模化蛋白质的研究。在干细胞研究中采用蛋白质组学技术建立蛋白质表达的分子图谱有助于揭示干细胞增殖和分化的分子机制。本文综述了干细胞蛋白质组学近年来的研究进展。     

肿瘤干细胞与纤维肉瘤的研究进展

肿瘤干细胞是近年来医学研究领域的热点之一,它具有强大的自我更新和致瘤能力以及不断分化的潜能。肿瘤干细胞学说认为肿瘤干细胞可能与肿瘤的产生、易复发和转移、具有强耐药性等有密切关系。有学者在造血系统肿瘤和多种实体瘤中分离并鉴定出肿瘤干细胞进一步证明了这种理论。现主要从肿瘤干细胞学说、生物学特性、鉴定分离、纤维肉瘤干细胞相关研究方面进行简要综述。