慢病毒介导的Stat3沉默对成牙骨质细胞分化、凋亡、自噬的影响

目的:构建Stat3-shRNA慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的信号传导及转录激活因子3(Stat3)沉默对小鼠成牙骨质细胞OCCM-30分化、凋亡、自噬的影响及相关机制。方法:构建含有Stat3shRNA的慢病毒载体,包装慢病毒后感染OCCM-30细胞,使用嘌呤霉素筛选出稳定细胞株。采用real-time PCR和Western Blot法检测慢病毒对Stat3的抑制效果。将细胞分成空白对照组、阴性对照组和Stat3抑制组三组,采用Western Blot检测Atg-5,Beclin-1,cleaved caspase-3,survivin蛋白水平的变化,使用real-time PCR法检测BSP,OCN,osterix在mRNA水平的变化。结果:成功构建Stat3-shRNA慢病毒表达载体并用慢病毒感染OCCM-30细胞,有效降低了Stat3的mRNA和蛋白的表达量。在mRNA水平上,Stat3抑制组BSP,OCN,osterix表达量降低。由Western Blot结果可知,Stat3抑制组Atg-5,Beclin-1,survivin蛋白表达量明显降低,cleaved caspase-3蛋白表达量增加。结论:慢病毒介导的Stat3-shRNA可有效抑制OCCM-30细胞内Stat3基因表达,从而抑制细胞分化和自噬,诱导凋亡,其相关机制可能是通过抑制Stat3信号转导通路实现的。     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

凉血化瘀方对肝细胞损伤中自噬与凋亡相关蛋白的影响

目的 研究凉血化瘀方对肿瘤坏死因子α（TNF-α）联合D-氨基半乳糖(D-GalN)所致肝细胞损伤中自噬和凋亡相关途径的影响,并探讨其分子调控机制。方法 体外培养人正常肝LO2细胞,用TNF-α（100 ng/mL）和D-GalN（44 μg/mL）诱导肝细胞损伤模型,荧光显微镜观察细胞的形态学变化;MTT法检测细胞活力;Western blot检测凋亡和自噬标志蛋白caspase-3、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ,凋亡和自噬调节蛋白Bax、Bcl-2和mTOR信号通路调控途径mTOR蛋白表达水平的变化。结果 凉血化瘀方能改善肝细胞病理损伤,并表现有剂量依赖性;治疗组细胞凋亡和自噬标志蛋白caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ表达下调,凋亡和自噬调控蛋白中负相关的Bcl-2表达上调、正相关的Bax表达下调,并呈现一定的量效关系,同时mTOR蛋白的表达也体现了剂量相关的下调作用。结论 凉血化瘀方对TNF-α+D-GalN所致肝细胞损伤的保护作用,与抑制细胞自噬和凋亡相关,其机制主要是参与自噬和凋亡相关途径中蛋白的表达调控。     

基于JNK信号通路探讨自噬、胰岛素抵抗在非酒精性脂肪性肝病中的发病机制

目的:探讨基于JNK信号通路自噬、胰岛素抵抗在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的发病机制。方法:采用高脂饮食喂养SD大鼠建立NAFLD模型，分为正常饮食组(ND组)、高脂饮食组(HFD组)、JNK抑制剂SP600125治疗组(SP600125组)、磷酸盐缓冲盐水PBS对照组(Control组)。ND组喂食正常饲料，HFD组、SP600125组和Control组喂食高脂饲料20周，SP600125组大鼠腹腔注射SP600125、Control组大鼠注射磷酸盐缓冲盐水PBS,每天1次，再延长8周。检测大鼠的胰岛素抵抗、C-Jun N末端激酶(JNK)信号通路及自噬相关蛋白的表达。结果:与ND组大鼠对比HFD组血糖、游离脂肪酸及胰岛素水平升高(均P<0.05),HFD组磷酸化JNK1(p-JNK1)蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。自噬相关蛋白Beclin-1(Beclin-1)、自噬相关蛋白LC-3Ⅱ(LC-3Ⅱ)、自噬相关基因3(Atg 3)和自噬相关基因5(Atg 5)表达水平升高(均P<0.05)。HFD组的胰岛素受体(IR)β亚基、IR底物-1和蛋白激酶B的...     

Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的探讨Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法将小鼠胚胎成纤维前脂肪细胞3T3-L1诱导分化为成熟脂肪细胞,随机分为对照组、Adropin组、自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组。对照组细胞不予特殊处理,Adropin组细胞加入Adropin (终浓度为1 000 nmol·L-1),自噬激动剂组加入西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),Adropin+自噬激动剂组细胞加入Adropin(终浓度为1 000 nmol·L-1)和西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),继续培养2 h;采用单丹磺酰尸胺染色检测各组细胞中自噬空泡情况,细胞免疫荧光染色法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)表达,采用Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62及PI3K/AKT通路蛋白PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)的表达。结果与对照组比较,Adropin组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。与对照组比较,自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。Adropin+自噬激动剂组与对照组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。与Adropin组比较,自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。与自噬激动剂组比较,Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。4组细胞中PI3K、AKT蛋白相对表达量两两比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。结论 Adropin可抑制脂肪细胞自噬,其机制可能是通过激活PI3K/AKT通路而实现。     

异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响

目的：探讨吸入麻醉药异氟醚对β淀粉样蛋白（Aβ）25-35诱导的大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法：将PC12细胞随机分为正常对照组（C组）、10   μmol•L-1Aβ25-35 处理组（Aβ组）、2%异氟醚处理组（Iso组）和2%异氟醚与10   μmol•L-1Aβ25-35联合处理组（Iso+Aβ组）。各组PC12细胞药物处理6 h后应用透射电镜观察自噬体,Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62和自噬信号调控基因p-mTOR、Beclin-1表达;药物处理24 h后应用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞存活率,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达。结果：与C组比较,Aβ组PC12细胞中可见大量的自噬体,LC3-Ⅱ、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,p62、p-mTOR和Bcl-2表达量降低（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;Iso组PCI2细胞未见自噬体,LC3-Ⅱ
表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;与Aβ组比较,Iso+Aβ组PC12细胞仅见少量自噬体,LC3-Ⅱ表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）,Bcl-2表达无明显变化（P>0.05）。结论：异氟醚能够抑制Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬的活化,促进凋亡蛋白的表达,其作用机制与激活自噬信号调控基因mTOR、抑制Beclin-1的表达有关。     

慈菇消脂丸对NF-κB介导的非酒精性脂肪肝病大鼠肝细胞凋亡的干预作用

目的通过观察慈菇消脂丸对高脂饮食诱导非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠肝细胞凋亡相关调控基因核转录因子κB(NF-κB)、B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响,探讨解毒化痰法治疗NAFLD的作用机制。方法 60只SPF级健康雄性Wistar大鼠,随机分为6组:正常对照组,模型组,慈菇消脂丸高、中、低剂量组,盐酸吡格列酮组,每组10只。采用高脂饮食喂饲大鼠建立NAFLD模型后,连续药物治疗6周。给药结束后,处死全部动物,取肝脏和血清。全自动生化分析仪检测各组大鼠肝功、血脂;HE染色观察肝脏的组织形态学特点;透射电子显微镜观察肝细胞的超微结构;Western Blot技术检测肝组织NF-κB、Bcl-2、Bax的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平升高(P0.01);肝组织呈中重度脂肪变性并同时伴有肝细胞凋亡;肝组织中NF-κB、Bax蛋白表达增强(P0.01),Bcl-2蛋白表达减低(P0.01),Bcl-2/Bax比值降低(P0.01)。与模型组比较,慈菇消脂丸各剂量组大鼠血清ALT、AST、TG、TC水平降低(P0.01);肝组织NF-κB、Bax蛋白表达减低(P0.01),Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值升高(P0.05)。与盐酸吡格列酮组比较,慈菇消脂丸高剂量下调NF-κB蛋白、上调Bcl-2蛋白表达的作用更显著(P0.01)。结论慈菇消脂丸能够明显改善NAFLD大鼠肝功及血脂;上调Bcl-2蛋白表达,降低NF-κB、Bax蛋白表达,使Bcl-2/Bax比值升高,从而抑制肝细胞凋亡,起到防治NAFLD的作用。     

自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤的影响研究

目的 研究自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤(H/RI)的影响,探讨自噬对小鼠睾丸组织缺血再灌注损伤(IRI)的影响。方法 以小鼠精原细胞系GC1 spg为研究对象构建H/RI模型,雷帕霉素(RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别作为自噬激动剂和抑制剂,设置对照组、模型组(H/RI)、自噬激动剂干预组(H/RI+自噬激动剂)、自噬抑制剂干预组(H/RI+自噬抑制剂)。用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)释放水平和凋亡水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞自噬相关基因Beclin1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达水平。结果 与对照组比较,模型组增殖能力、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达水平明显下降(P<0.01),p62和Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01),ROS水平、细胞凋亡率、Bax mRNA相对表达水平明显上升(P<...     

Met/HGF通路抑制缺血再灌注心肌细胞自噬作用的研究

目的 探究Met/HGF蛋白通路抑制细胞自噬在减轻心肌缺血再灌注损伤中的作用和机制.方法 鼠离体心肌细胞分为对照组、缺血再灌注(IR)组、Met转染组、Met siRNA转染组、Met转染+肝细胞生长因子(HGF)激活剂组共5组,通过转染的方法使Met过表达或不表达,进行缺血再灌注处理后提取细胞蛋白,Western blot法检测Met、HGF,下游通路蛋白AMPK、PI3K,自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1及凋亡蛋白Bcl-2的表达水平.结果 Western blot结果显示,与对照组相比,在Met转染组及HGF激活剂组中,过表达的Met及HGF的激活能显著增加下游信号转导通路蛋白PI3K、AMPK的表达量(P＜0.05),同时自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1的表达量均明显下降(P＜0.05);而在IR组及Met siRNA转染组中则呈相反趋势(P＜0.05).结论 Met/HGF通路的激活能够抑制细胞自噬并减轻心肌细胞缺血再灌注损伤.     

选择性MAO-B抑制剂TM-5对胶质瘤U87细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨选择性单胺氧化酶B(MAO-B)抑制剂TM-5对胶质瘤U87细胞体外自噬及凋亡的影响。方法 正常培养胶质瘤细胞株U87,随机分为6组：对照组不做处理,5、10、25、50、100μmoL/L TM-5组分别予以5、10、25、50、100μmoL/L TM-5处理细胞,每组设3个复孔。采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测促凋亡蛋白Bcl-2相关蛋白X(Bax)、抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的基因表达;蛋白质免疫印迹（WB）检测细胞凋亡相关蛋白Bax和切割后半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)以及自噬相关标志蛋白Beclin-1、自噬相关蛋白1轻链-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和P62表达。结果 与对照组比较,10、25、50、100μmoL/L TM-5组U87细胞存活率降低（P <0.05）,选取5、10、25μmoL/L TM-5组（细胞存活率>50%）进行后续实验。与对照组比较,10、25μmoL/L TM-5组相对细胞凋亡率、细胞中LC3-Ⅱ和Bax蛋白相对表达量升高,...     

炙甘草汤通过调控自噬-凋亡平衡改善糖尿病性心肌病(DCM)大鼠心功能

目的：研究炙甘草汤对糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)大鼠心功能的改善作用及相关机制。方法：将40只雄性SD大鼠随机分为4组：对照组,模型组、炙甘草汤低剂量组,炙甘草汤高剂量组。通过链脲佐菌素( streptozotocin,STZ)注射制作DCM模型,用不同剂量炙甘草汤治疗,通过检测血清脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)及超声心动图评估心功能,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax评估心肌凋亡水平,自噬相关蛋白LC3-I/II,P62,Beclin-1评估心肌自噬水平。结果：与模型组相比,炙甘草汤低剂量组和高剂量组均显著降低心力衰竭大鼠BNP及左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension,LVESD),左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)(P<0.05),升高左室射血分数(left ventricular ejection fraction,EF),左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,FS)水平,说明炙甘草汤改善DCM模型组大鼠心功能,高剂量组尤其明显。DCM模型组抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,促凋亡蛋白Bax表达升高,炙甘草汤组抗凋亡蛋白Bcl-2表达回升,促凋亡蛋白Bax表达下降,说明DC模型组大鼠心肌细胞凋亡率增加,炙甘草汤抑制心肌细胞凋亡。DC模型组自噬相关蛋白LC3-II,Beclin-1表达下降,P62表达升高,炙甘草汤组LC3-II,Beclin-1表达回升,P62表达下降,说明DCM模型组大鼠心肌细胞自噬水平下降,炙甘草汤增强心肌细胞自噬水平。结论：炙甘草汤能改善糖尿病性心肌病(DCM)大鼠心功能,这可能与其抑制心肌细胞凋亡,增强心肌细胞自噬相关。     

TNF-琢对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞自噬和增殖的影响及作用机制研究

目的观察TNF-α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）自噬和增殖的影响,并进一步通过抑制NF-资B通路来探讨这一影响的作用机制。方法以RASF细胞株MH7A为研究对象,在一阶段实验中,根据5ng/mlTNF-琢处理的时间点不同,将细胞分为6组,即0、3、6、12、24及48h组。在二阶段实验中,将细胞分为4组,即Bay组：细胞用5滋g/mlBay11-7082处理;TNF-α组：细胞用5ng/mlTNF-琢刺激;Bay+TNF-琢组：细胞用5滋g/mlBay11-7082预处理2h,再用5ng/mlTNF-琢刺激;正常对照（Ctrl）组：细胞不作处理。MTT法检测细胞相对活性;共聚焦显微镜下采用GFP-LC3来示踪自噬形成;Westernblot法检测细胞内P-p65、自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-I（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）以及唯Bcl-2同源-3域蛋白-1（Beclin-1）蛋白表达水平;Realtime-PCR法检测细胞内Beclin-1mRNA表达水平;细胞免疫荧光法检测P-p65在细胞中表达及定位。结果与0h组相比,12、24、48h组细胞相对活性均明显升高（均P＜0.05）。GFP-LC3-Ⅱ腺病毒转染细胞后,与0h组相比,TNF-琢刺激滑膜细胞后自噬小体形成明显增多,其中24h组最为明显。与0h组相比,3、6、12h组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,6、12、24、48h组Beclin-1蛋白表达水平均明显升高（均P＜0.05）。与0h组相比,6、12、24、48h组Beclin-1mRNA表达水平均明显升高（均P＜0.05）。与TNF-α组相比,Bay+TNF-琢组细胞内P-p65蛋白表达及入核明显减少。与Ctrl组比较,Bay组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降,与TNF-琢组比较,Bay+TNF-琢组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降（均P＜0.05）。与Ctrl组比较,Bay组细胞相对活性明显降低（P＜0.05）;与TNF-琢组比较,Bay+TNF-琢组细胞相对活性明显降低（P＜0.05）。与TNF-琢组相比,Bay+TNF-琢组细胞自噬小体明显减少。与Ctrl组比较,Bay组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降（均P＜0.05）;与TNF-α组比较,Bay+TNF-琢组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降（均P＜0.05）。与Ctrl组比较,Bay组Beclin-1mRNA表达水平明显下降（P＜0.05）;与TNF-琢组比较,Bay+TNF-α组Beclin-1mRNA表达水平明显下降（P＜0.05）。结论TNF-α能诱导RASF自噬和增殖活性,而NF-资B通路则能上调TNF-α刺激下的细胞自噬和增殖活性。     

IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

目的 探究肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法 衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组）,Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA 水平,Western blot 检测 IRE1α/p- IRE1α、CHERP 表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素 A1 （Bafilomycin A1）处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1 组）,Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）,p62表达下调（P<0.05）。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001）,4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1（P<0.01）、ATG5（P<0.001）、ATG7（P<0.001）mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01）,CHERP蛋白表达上调（P<0.05）,胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素 A1 处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1 组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01）,ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。     

HMGB1下调的作用：通过抑制神经元细胞自噬和凋亡减轻大鼠脑出血后的神经元损伤

目的 探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）在大鼠脑出血后对神经元细胞自噬和凋亡的作用机制。方法 将20只Wistar大鼠随机分为4组（5只/组）：假手术组（Sham组）、脑出血组、HMGB1中和抗体治疗（anti-HMGB1）组、control IgG组。模型组选择颅内纹状体注射0.2 U/mL胶原酶Ⅳ建立脑出血大鼠模型。Sham组颅内注射2 μL生理盐水,术后尾静脉注射PBS,6 h后再次注入等量PBS;anti-HMGB1组术后尾静脉注射1 mg/kg anti-HMGB1单克隆抗体,6 h后再次注入等量抗体;control IgG组术后尾静脉1 mg/kg anti-IgG单克隆抗体,6 h后再次注入等量抗体。采用改良神经损害程度（mNSS）评分评估大鼠神经功能和损伤程度。TUNEL染色检测纹状体神经元凋亡。Western blot检测血肿周围脑组织神经元细胞HMGB1、自噬蛋白（Beclin-1、LC3-II和LC3-I）和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3）的表达。免疫组化检测纹状体组织中HMGB1阳性表达。ELISA检测血清HMGB1含量变化。结果 造模成功后,脑出血组中mNSS评分增加（P<0.05）,给予anti-HMGB1单克隆抗体后,mNSS评分减少（P<0.05）。与 Sham 组相比,脑出血组大鼠纹状体神经元凋亡率增加（P<0.001）,Beclin-1、LC3-II、Bax 和 cleavedcaspase-3的表达增加（P<0.05）,而LC3-I和Bcl-2的表达减少（P<0.05）,HMGB1含量增加（P<0.05）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后,大鼠纹状体神经元凋亡率减少（P<0.05）,Beclin-1、LC3-II、Bax和cleaved caspase-3的表达减少（P<0.05）,而LC3-I和Bcl-2的表达增加（P<0.05）,HMGB1含量减少（P<0.05）。结论 anti-HMGB1单克隆抗体下调HMGB1水平改善大鼠脑出血后的神经功能,其机制可能是抑制大鼠脑出血后的神经元细胞自噬和凋亡。     

丹蛭降糖胶囊对肥胖大鼠骨骼肌IRE1α-JNK信号通路的干预效应

目的 探讨丹蛭降糖胶囊对高脂饮食诱导的肥胖大鼠骨骼肌内质网应激（ERs）相关因子肌醇需求激酶1α（IRE1α）、磷酸化IRE1α（p-IRE1α）、c-jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为普通饮食组（NC组）、单纯高脂饮食组（HF组）、高脂饮食＋丹蛭降糖胶囊组（FD组）,每组各10只。应用全自动生化分析仪测定骨骼肌三酰甘油（TG）含量;Western blot检测骨骼肌组织IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK的蛋白表达水平。结果 1NC组、HF组以及FD组骨骼肌内TG含量分别为（1.87±0.72）、（3.03±0.71）、（2.71±0.58）μmol/g。与NC组比较,HF组大鼠骨骼肌TG含量显著增高（P=0.005）;与HF组比较,FD组大鼠骨骼肌TG含量明显下降（P=0.024）。2Western blot检测结果显示,HF组p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK较NC组明显升高（P〈0.05）;FD组p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK较HF组明显降低（P〈0.05）。3Pearson相关性分析发现,大鼠骨骼肌TG含量与HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK均呈正相关（r=0.63、0.66、0.57,均P〈0.01）。结论丹蛭降糖胶囊可减轻骨骼肌脂质沉积,调节ERs相关IRE1α-JNK通路,从而改善骨骼肌胰岛素抵抗。     

P62-ASC泛素化介导自噬对NLRP3炎症小体调节的机制研究

目的 探讨棕榈酸(PA)刺激下P62介导的自噬和含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)炎症小体相互作用机制.方法 分离培养小鼠Kupffer细胞(KCs),分对照组、PA组、渥曼青霉素组和雷帕霉素组.Western blot测定各组KCs中LC3、NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)及Beclin-1表达水平的变化,激光共聚焦显微镜观察P62与ASC,以及P62与LC3在细胞中的共定位情况;免疫共沉淀技术测定PA刺激前后P62与ASC、LC3之间的相互作用;Western blot测定PA处理12 h前后ASC泛素化改变情况.结果 与对照组比较,PA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、NLRP3、ASC、caspase-1和Beclin-1表达水平明显升高(P<0.05).而渥曼青霉素组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ较PA组下降,NLRP3、ASC及caspase-1表达水平较PA组增加(P<0.05);雷帕霉素组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ较PA组增加,而NLRP3、ASC及caspase-1表达水平较PA组减少(P<0.05).激光共聚焦结果显示KCs中P62与ASC、P62与LC3共定位,且在PA处理24 h后明显增强.免疫共沉淀结果表明,与对照组比较,PA组P62、ASC形成的共聚体明显增多.Western blot检测结果表明,PA组ASC泛素化水平较对照组增强.结论 KCs在PA刺激下,自噬与NLRP3炎症小体的表达均增强,且促进自噬能降低NLRP3炎症小体的表达,对KCs具有保护作用.P62对ASC泛素蛋白的识别在自噬对NL-RP3炎症小体的调节中非常关键.     

miR-451a对慢性心衰细胞模型心肌细胞H9c2凋亡与自噬的影响

目的探究miR-451a对慢性心衰细胞模型心肌细胞H9c2凋亡与自噬的作用机制。 方法采用1 μmol/L阿霉素(DOX)建立慢性心衰细胞模型。将细胞实验分为Control组(正常心肌细胞H9c2)、DOX组(DOX培养)、DOX+miR-NC组(DOX培养转染对照miR-NC)、DOX+miR-451a组(DOX培养转染miR-451a模拟物miR-451a)、DOX+miR-451a+CCI-779组(DOX和CCI-779培养转染miR-451a)。qRT-PCR检测各组细胞miR-451a相对表达水平；CCK-8和流式细胞术分别检测细胞增殖活性与凋亡；Western blotting检测剪切的Caspase-3(cleaved Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3I(LC3I)、LC3II、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70s6k、磷酸化mTOR(p-mTOR)、p-p70s6k蛋白表达。 结果成功建立慢性心衰细胞模型。与Control组比较,DOX组miR-451a相对表达水平、细胞活性、p-mTOR、p-p70s6k蛋白表达降低,而凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I蛋白表达升高。与DOX+miR-NC组比较,DOX+miR-451a组miR-451a相对表达水平、细胞活性、p-mTOR、p-p70s6k蛋白表达升高,而凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I蛋白表达降低。与DOX+miR-451a组比较,DOX+miR-451a+CCI-779组细胞活性降低,凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I蛋白表达升高。 结论miR-451a通过抑制mTOR信号通路促进慢性心衰细胞模型心肌细胞H9c2凋亡和自噬。     

自噬体及凋亡小体对新生小鼠支气管肺发育不良调控作用

目的探究自噬体及凋亡小体对新生小鼠支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）调控作用。 方法新生SD小鼠36只随机分为对照组、模型组、干预组,每组12只,对照组置于空气中,模型组、干预组置于封闭氧箱中（氧浓度维持在60%）以制备BPD模型,干预组小鼠从造模开始给予自噬抑制剂（氯喹）20 mg/kg腹腔注射,1次/d,连续21 d。22 d时观察各组小鼠一般情况,采用HE染色观察各组小鼠肺组织病理变化,透射电镜下观察各组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构,采用Western Blot检测肺组织中自噬相关蛋白［P62、微管相关蛋白轻链3B（microtubule associated protein light chain 3B,LC3B）］及凋亡相关蛋白［Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）］表达水平。 结果干预组小鼠精神状态、毛发生长、饮食情况、呼吸情况、体重等较模型组明显好转,未出现死亡小鼠。干预组小鼠肺组织病理改变较模型组明显改善,肺泡Ⅱ型上皮细胞胞浆中自噬体及凋亡小体数量较模型组明显减少。模型组小鼠肺组织中LC3B、P62、Bax、caspase-3水平显著高于对照组（P＜0.05）;干预组小鼠肺组织中LC3B、P62、Bax、caspase-3水平显著低于模型组（P＜0.05）;干预组小鼠肺组织中LC3B、P62、Bax、caspase-3水平显著高于对照组（P＜0.05）。 结论新生小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬过度活化后自噬体增多,促进肺泡Ⅱ型上皮细胞大量凋亡,凋亡小体增加,从而导致BPD发生,这可为BPD预防和治疗提供理论支持。     

白芍总苷对TNF-α诱导Caco-2炎性细胞模型的作用机制

目的 研究白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导的人结肠上皮Caco-2炎性细胞自噬和凋亡水平的影响,并探究其保护机制。方法 将对数生长期的Caco-2细胞分为对照组、模型组和给药组。其中对照组细胞常规培养,模型组和给药组细胞TNF-α 100ng/ml刺激48h建立炎性细胞模型;给药组细胞使用不同浓度TGP培养,对照组和模型组细胞使用等量完全培养基培养;用噻唑蓝(MTT) 法检测细胞增殖情况;利用酶联免疫吸附试验检测各组中白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和白介素6(interleukin 6,IL-6)蛋白质水平表达变化;采用Western blot法检测程序性死亡受体1(Beclin-1)、微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、Bcl-2蛋白的表达。结果 TGP对Caco-2 炎性细胞模型的增殖具有抑制作用,与正常组比较,TNF-α诱导的Caco-2炎性细胞中IL-1β、IL-6的表达明显增高(P<0.05);与模型组比较,TGP能够下调IL-1β、IL-6的表达水平,Beclin-1、LC3B的表达水平降低,Bcl-2表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TGP能够下调IL-1β、IL-6的表达水平,抑制Beclin-1、LC3B蛋白表达水平,上调抗凋亡基因 Bcl-2 表达,TGP对TNF-α诱导Caco-2炎性细胞模型的治疗作用与抑制炎症及调节肠上皮细胞自噬有关。     

竹节香附素A调控mTOR通路对肠癌HCT116细胞自噬及凋亡的影响

目的 探讨竹节香附素A(RA)抑制HCT116细胞的增殖及其相关机制.方法 利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测RA对HCT116细胞的增殖抑制;流式细胞术(FCM)检测RA对细胞凋亡的影响;透射电镜观察RA诱导自噬;Western blot检测凋亡、自噬相关蛋白表达.结果 RA能够明显抑制HCT116细胞的增殖,并呈浓度、时间依赖性.透射电镜观察到双层膜自噬体的存在;FCM显示RA能够诱导HCT116细胞凋亡,且随着浓度的增大凋亡率增加.Western blot检测显示,自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达增高;抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少;而促凋亡蛋白Bax,凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)表达增加;RAPA靶蛋白(mTOR)信号通路中mTOR蛋白表达增加,磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达减少.加入mTOR通路抑制剂雷帕霉素(RAPA)后Beclin-1、LC3蛋白表达增加,凋亡率增加,且Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达也增加.结论 RA能够抑制肠癌细胞HCT116的增殖;并能诱导细胞自噬和凋亡,其机制可能是通过调控mTOR信号通路实现.