LPS信号转导分子TLR4表达与小鼠肝损伤的关系

目的：探讨脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)信号转导分子，TLR4(Toil-like receptor 4,TLR4)与肝脏损伤的关系。方法：小鼠腹腔注射LPS后不同时间点取肝脏组织，HE染色观察病理改变，RT-PCR法检测肝组织，TLR4 mRNA的表达。结果：腹腔注射LPS后24h小鼠肝脏出现明显炎性浸润、坏死，肝组织TLR4 mRNA的表达在注射LPS后6，12h明显抑制，24h则基本恢复。结论：LPS致肝损伤呈时间依从性；LPS信号转导分子TLR4在介导LPS肝损伤中起重要作用。。     

脂多糖诱发肝损伤机理的初步研究

目的:探讨LPS肝损伤的信号转导途径及LPS诱导肝细胞凋亡的规律。方法:Balb/c小鼠腹腔注射LPS建立内毒素血症模型,在不同时间点取其肝脏,HE染色观察病理改变,RT-PCR法检测肝组织TLR4的表达。TUNEL法检测肝细胞凋亡,免疫组化法检测bax、bcl-2、Fas、Fasl表达。结果:LPS注入腹腔后24h小鼠肝脏开始出现明显病理改变;3～6h肝细胞凋亡达高峰,12h后明显减少;肝脏TLR4在LPS注射3h后显著下调,6～12h明显受抑制,24h后则基本恢复;LPS刺激后3～6h肝脏bax、Fas表达达高峰,而bcl-2、Fasl表达在6～12h达到高峰,随后都逐渐下降。结论:LPS刺激肝脏后,肝损伤呈时间依从性,凋亡是其细胞死亡方式之一。LPS刺激后,肝脏TLR4表达呈时间依从性,TLR4表达下调可能是对LPS产生的耐受现象,是机体抗损伤的一种保护性的下调。LPS所致肝细胞凋亡是多因素作用的结果。     

LPS诱导鼠肝脏和腹腔巨噬细胞TLR4表达和肝损伤的动态分析

目的观察LPS刺激后不同时间点肝脏和腹腔巨噬细胞的TLR4表达,以及分析TLR4动态变化规律.方法以BALB/c小鼠为模型,腹腔注射LPS后不同时间取肝脏和腹腔巨噬细胞抽提RNA,逆转录-聚合酶链式反应半定量分析TLR4mRNA各时相的表达.体外培养的腹腔巨噬细胞不同剂量LPS刺激后观察TLR4mRNA的表达规律.结果注射LPS 3 h后肝脏和腹腔巨噬细胞TLR4mRNA开始明显下降,第6、12 h基本检测不到,24 h后逐渐恢复,30 h小鼠死亡时基本恢复到正常.不同浓度LPS均下调腹腔巨噬细胞TLR4mRNA的表达,剂量之间差异无显著性.血中ALT在3h开始升高,6h达高峰,肝细胞病理变化出现在12 h,随时间的延长而加重.结论LPS可直接损伤肝细胞,这种损伤与TLR4无关.LPS可能通过TLR4介导肝组织的病理改变.     

脂多糖诱发肝损伤机理的初步研究

目的：探讨LPS肝损伤的信号转导途径及LPS诱导肝细胞凋亡的规律。方法：Balb／c小鼠腹腔注射LPS建立内毒素血症模型，在不同时间点取其肝脏，HE染色观察病理改变，RT-PCR法检测肝组织TLR4的表达。TUNEL法检测肝细胞凋亡，免疫组化法检测bax、bcl-2、Fas、Fasl表达。结果：LPS注入腹腔后24h小鼠肝脏开始出现明显病理改变；3-6h肝细胞凋亡达高峰，12h后明显减少；肝脏TLR4在LPS注射3h后显著下调，6-12h明显受抑制，24h后则基本恢复；LPS刺激后3-6h肝脏bax、Fas表达达高峰，而bcl-2、Fasl表达在6-12h达到高峰，随后都逐渐下降。结论：LPS刺激肝脏后，肝损伤呈时间依从性，凋亡是其细胞死亡方式之一。LPS刺激后，肝脏TLR4表达呈时间依从性，TLR4表达下凋可能是对LPS产生的耐受现象，是机体抗损伤的一种保护性的下调。LPS所致肝细胞凋亡是多因素作用的结果。     

镉诱导小鼠急性肝损伤模型的研究

目的 通过腹腔注射氯化镉( CdCl2 )建立小鼠急性肝损伤模型,初步阐明其分子机制. 方法 以4 mg/kg CdCl2腹腔注射小鼠,观察各时间点小鼠肝组织病理变化和血清丙氨酸氨基转移酶( ALT)、天冬氨酸氨基转移酶( AST)的变化,探索CdCl2 引起明显肝损伤的染毒时间;以1、2、4 mg/kg CdCl2 对小鼠腹腔注射染毒,筛选出CdCl2 诱导急性肝损伤的最佳染毒剂量;检测血清丙二醛( MDA)以及肝匀浆MDA、一氧化氮( NO )、谷胱甘肽( GSH )、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-PX)含量,观察氧化应激在CdCl2 诱导的小鼠肝损伤中的作用. 结果 以4 mg/kg CdCl2 腹腔注射18 h后,肝脏组织出现片状坏死,肝细胞严重气球样变,血清ALT和AST明显升高. 此外,与对照组比较,CdCl2 处理18 h后,血清与肝脏MDA及肝脏NO水平显著升高,肝脏GSH、GSH-PX活性明显降低. 结论 4 mg/kg CdCl2 腹腔注射18 h后可成功建立小鼠急性肝损伤模型,其发生可能与MDA和NO升高,肝组织GSH含量、GSH-PX活性降低相关.     

内毒素致伤大鼠肝组织SSeCKS mRNA水平的研究

目的 观察内毒素/脂多糖(LPS)致伤大鼠肺组织中Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKs)mRNA的表达变化.方法 SD大鼠腹腔注射LPS建立肝损伤模型,依据注射时相和剂量不同随机分组.用Real-time PCR法检测肝组织SSeCKS mRNA水平的表达情况.结果 不同剂量LPS注入腹腔后8小时均可引起肝脏SSeCKS的表达变化,且呈现一定的剂量依赖关系.5 mg/kg LPS腹腔注射后肝脏SSeCKS mRNA水平的表达量达到最高,此后虽然增加LPS剂量但也不能诱导SSeCKS mRNA水平表达量的增加;5 mg/kg LPS腹腔注射后肝脏SSeCKS的表达变化呈现时间依赖关系,LPS注射后1小时肝脏SSeCKS mRNA水平表达增高,12小时达到最高水平,此后SSeCKS一直维持高水平.结论 LPS引起肝脏SSeCKS mRNA表达呈时间和剂量依赖性变化,提示SSeCKS与LPS所致肝损伤相关.     

当归制剂对脂多糖诱导的肝组织炎性损伤的影响及分子机制初探

目的　探讨应用当归制剂对脂多糖诱导的肝组织炎症反应的影响及其分子机制。方法　将ICR小鼠分为用药组、实验对照组及正常对照组 3组 ,采用脂多糖 (LPS)配合卡介苗 (BCG)注射法建立小鼠 (用药组和实验对照组 )肝脏炎性损伤模型 ,经腹腔给用药组小鼠注射当归制剂 ,给实验对照组注射等量生理盐水 ,连续给药 10d后 ,常规组织病理学观察 ,比较小鼠肝组织炎症反应情况。同时用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)检测小鼠脾脏单个核细胞TNF -αmRNA表达的变化。结果　用药组小鼠肝脏的炎症反应明显弱于实验对照组 (P <0 .0 5 ) ;肝脏炎性损伤小鼠脾脏单个核细胞TNF -αmRNA的表达在注射LPS后 4h较正常对照组小鼠明显增加 (P <0 .0 1) ,在注射后 7h时达到峰值 ,而后有所下降 ;在注射LPS后 7h ,用药组小鼠TNF -αmRNA的表达与实验对照组相比 ,无显著差异。结论　当归制剂能显著抑制脂多糖诱导的肝组织炎症反应 ,明显减轻肝组织的炎性损伤 ,然而其主要抑制作用可能并非通过影响炎性介质TNF -αmRNA的表达来实现。     

内毒素休克大鼠肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达

目的 探讨内毒素休克大鼠肾组织Toll样受体2(TLR2) mRNA和TLR4 mRNA的表达变化,以及血管活性肠肽(VIP)和甲基泼尼松龙(MP)的作用及可能机制.方法 采用大肠杆菌脂多糖(LPS)(E coli O55:B5)10 mg/kg静脉注射,建立大鼠内毒素休克模型(LPS组,n=16);LPS+VIP组(n=16)建模后注射VIP(5 nmol/kg),LPS+VIP+MP组(n=16)注射VIP(5 nmol/kg)和MP(3 mg/kg);另设生理盐水对照组(n=8).透射电子显微镜观察LPS注射6 h和24 h大鼠肾组织病理学变化;RT-PCR测定肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达.结果 建模后6 h,电子显微镜下见LPS组肾小球毛细血管内皮细胞肿胀,线粒体空泡变性;建模后24 h,可见LPS组肾小管细胞线粒体肿胀、空泡变性,细胞核轻度固缩;LPS+VIP组及LPS+VIP+MP组肾组织病变轻于同期LPS组.LPS注射6 h,LPS组、LPS+VIP组及LPS+VIP+MP组肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达均高于对照组(P<0.01);LPS注射24 h,LPS组TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达高于其他组(P<0.01).结论 内毒素休克大鼠肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达增强;VIP和MP干预可减轻肾脏损伤,可能与其下调TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达有关.     

环氧化酶2在肝衰竭模型肝损伤中的表达

目的:探讨环氧化酶2(COX 2)在肝衰竭损伤肝组织中的表达.方法:BALB/c小鼠随机分为正常对照组(n=6)和肝衰竭组(n=24),前者以生理盐水200μl腹腔注射,后者采用内毒素(LPS)10 μg/kg和D-氨基半乳糖(D-Gal)900 mg/kg联合腹腔注射,对照组在注射后8 h、肝衰竭组在注射后不同时点(2、4、6、8 h)检测血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF α)、细胞黏附分子1(ICAM 1);处死动物,以原位灌注消化法分离肝Kupffer细胞后,半定量RT PCR检测其中COX-2 mRNA的表达.结果:与对照组相比,肝衰竭组血浆ALT、AST、IL-10、TNF α、ICAM-1水平均显著升高(P＜0.05),且随损伤时间的延长而逐渐升高(P＜0.001);COX-2 mRNA仅在肝衰竭组表达,表达量随肝损伤时间延长也逐渐增高(P＜0.001).结论:COX-2在损伤肝组织中大量表达,且表达量随肝损伤程度而升高,提示其可能参与了LPS/D-Gal诱导的肝衰竭模型肝损伤过程.     

脓毒症早期大鼠肝脏Toll样受体4基因表达及干预性研究

目的:探讨严重腹腔感染所致脓毒症大鼠肝脏Toll样受体4(Tolllikereceptor4,TLR4)基因表达变化规律及对其调节机制进行初步探讨。方法:采用大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)模型造成脓毒症。将96只大鼠随机分为正常对照组、假手术组、CLP组、地塞米松(DXM)干预组,于CLP后2、4、6、12、24h处死动物,留取肝脏标本,以半定量逆转录多聚酶链反应技术及相关软件分析不同组TLR4mRNA、TNF鄄αmRNA的表达,检测血清丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及肝脏组织病理,评估肝脏损伤情况。结果:CLP组2h后肝脏TLR4mRNA、TNF鄄αmRNA及血清ALT、AST比正常对照组明显增多(P﹤0.01);DXM干预组各时间点TLR4mRNA、TNF鄄αmRNA的表达及血清ALT、AST较单纯CLP组显著降低(P﹤0.01),24h病理切片显示肝损伤轻于CLP组。结论:严重腹腔感染可致大鼠肝脏TLR4mRNA持续高表达,与肝脏的损伤密切相关;早期应用DXM可抑制TLR4mRNA的表达,减轻肝脏损伤。DXM抑制腹腔感染所致的炎症反应可能与抑制TLR4的表达有关。     

何首乌醇提物对脂多糖诱导大鼠肝TLR4/TRIF/IRF-3信号通路的影响

目的：研究大鼠经革兰阴性菌外膜成分脂多糖（LPS）诱导后,何首乌醇提物（PMT）对大鼠的肝毒性,并探讨其肝损伤机制与固有免疫炎症信号通路Toll样受体4（TLR4）-干扰素调节因子3（IRF-3）的关系。方法雄性SD大鼠随机分为正常对照组、对乙酰氨基酚（APAP,625 mg/kg）组、PMT 6 g/kg（PMT-L）和12 g/kg（PMT-H）组、脂多糖（LPS,4 g/L）组、（LPS+APAP）和（LPS+PMT-L/-H）组。后4组经尾静脉注射LPS 4 mg/kg,2 h后各实验组分别灌胃给予相应药物每日1次,连续7 d。观察每日大鼠体质量变化,分别在给药结束后2 h、14 h、5 d和8 d经HE染色检测大鼠组织形态变化,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法及Western印迹法检测肝细胞中TLR4信号通路干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）、IRF-3的表达情况。结果大鼠尾静脉注射LPS诱导后2 h,肝实质出现微小肉芽肿,其后,LPS组大鼠肝损伤逐渐恢复。诱导第8天时,LPS组大鼠肝组织结构清晰完整,LPS+APAP组和LPS+PMT各剂量组肝细胞灶状坏死,伴炎细胞浸润。RT-qPCR检测法和Western印迹法检测结果显示,单独灌胃何首乌醇提物的大鼠肝细胞中TLR4、TRIF和IRF-3的mRNA和蛋白表达水平与正常组相比无显著差异,而经LPS诱导的大鼠肝细胞TLR4、TRIF和IRF-3 mRNA和蛋白表达水平显著高于正常对照组,与LPS组相比有显著性差异（P＜0.05）,但PMT各剂量组间相比无显著差异。结论何首乌醇提物经LPS诱导能引起肝损伤,其引起的肝毒性与正性调控TLR4/IRF-3信号通路的表达有关,其肝损伤程度与给药剂量无关,提示TLR4/IRF-3信号通路的激活是LPS诱导何首乌醇提物肝损伤的作用机制之一。     

油酸/脂多糖致伤老年大鼠MODS的Toll样受体4 mRNA表达变化及意义

目的观察油酸/脂多糖(OA/LPS)致伤的老年大鼠多器官功能障碍综合征(MODSE)主要脏器组织Toll样受体4(TLR4)mRNA表达变化,探讨TLR4在MODSE发生中的作用.方法80只SD大鼠分为老年组及青年组,予以油酸(OA,0.25ml/kg)和脂多糖(LPS,3.5 mg/kg)分次静脉注射(间隔4 h),建立二次打击MODSE和青年MODS模型.观察对照组及伤后2、6、24h,重要器官(肺、心、肝、肾)病理及功能的变化,分别检测肺、心、肝和肾组织中TLR4 mRNA表达变化.结果OA/LPS致伤后,肺脏损害出现最早,PaO2于2 h降至最低值,而心、肝、肾功能损害指标于6 h达峰值.在同一时相点,老年鼠脏器损害重于青年鼠(P＜0.05,P＜0.01).致伤后肺、心、肝和肾组织中TLR4mRNA表达均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);其中以肺组织中最高,升高幅度最大,于2 h达峰值;心、肝、肾组织中于6 h达峰值.在相同时相点老年鼠各组织中TLR4 mRNA表达高于青年鼠(P＜0.05,P＜0.01).结论油酸 脂多糖所致老年鼠多器官功能障碍重于青年鼠,以肺损伤出现最早,损伤最重.致伤后大鼠肺、心、肝、肾组织中TLR4 mRNA表达升高,老年组高于青年组,以肺组织中最高,升高幅度最大,在MODSE发病机制中起重要作用,可能是MODSE发生过程中肺脏最先且严重受损的原因之一.     

荆芥、桂枝挥发油对LPS体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4通路的影响

目的:观察VOHS(荆芥挥发油)、VOCC(桂枝挥发油)体外干预小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4通路的抗炎机制.方法:1.常规培养小鼠腹腔巨噬细胞,加入不同浓度的VOHS、VOCC,药物作用24h后采用MTT法检测细胞存活率.2.常规培养小鼠腹腔巨噬细胞,分组加药培养24h后,提取细胞总RNA,采用RT-PCR测定TLR2...     

内毒素休克大鼠肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达

目的 探讨内毒素休克大鼠肾组织Toll样受体2（TLR2） mRNA和TLR4 mRNA的表达变化,以及血管活性肠肽（VIP）和甲基泼尼松龙（MP）的作用及可能机制。方法 采用大肠杆菌脂多糖（LPS）（E coli O55:B5）10 mg/kg静脉注射,建立大鼠内毒素休克模型(LPS组,n=16);LPS+VIP组(n=16)建模后注射VIP（5 nmol/kg）,LPS+VIP+MP组（n=16）注射VIP（5 nmol/kg）和MP（3 mg/kg）;另设生理盐水对照组（n=8）。透射电子显微镜观察LPS注射6 h和24 h大鼠肾组织病理学变化;RT-PCR测定肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达。结果 建模后6 h,电子显微镜下见LPS组肾小球毛细血管内皮细胞肿胀,线粒体空泡变性;建模后24 h,可见LPS组肾小管细胞线粒体肿胀、空泡变性,细胞核轻度固缩;LPS+VIP组及LPS+VIP+MP组肾组织病变轻于同期LPS组。LPS注射6 h,LPS组、LPS+VIP组及LPS+VIP+MP组肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达均高于对照组（P<0.01）;LPS注射24 h,LPS组TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达高于其他组（P<0.01）。结论 内毒素休克大鼠肾组织TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达增强;VIP和MP干预可减轻肾脏损伤,可能与其下调TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达有关。     

TLR4siRNA预处理防治小鼠急性肝损伤

目的急性肝功能衰竭是重要的临床综合征。近年来,对急性肝功能衰竭的治疗进展甚微,如何从根本上解决这一难题依然任重道远。方法本研究基于pSilencer4．1-CMVneosiRNA表达载体,设计并构建了TLR4siRNA表达载体。经体外细胞转染实验,筛选了3条抑制效果较好的表达载体,进一步行体内动物实验。进行酶切及测序鉴定,体外评估其对转染RAW26d．7细胞TLR4mRNA、蛋白表达水平的抑制作用,进一步评价了TLR4siRNA对TNF—α、MIP-2水平的影响,及对LPS诱导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的作用;之后再采用3条抑制效率较高的TLR4siRNA进行体内试验,采用尾静脉高压水注射法转染C57BL／6小鼠,静默TLR4的表达,再采用D—GalN／LPS联合诱导小鼠急性肝损伤,观察TLR4siRNA对D—GalN／LPS诱导的肝损伤小鼠是否有保护作用,观察TNF-α、MIP-2水平的变化,观察肝细胞凋亡水平变化。结果D—GalN／LPS联合给药前48h及24hTLR4siRNA预处理可明显降低ALT及AST的升高幅度,TNF-α及MIP-2的mRNA及细胞因子水平亦被抑制,TUNEL阳性肝细胞百分率下降。TLR4siRNA预处理可明显减轻D—GalN／LPS对C57BL／6小鼠的肝损害作用,降低小鼠的死亡率。通过TLR4siRNA阻断TLR4表达可能有助于控制LPS炎性反应,防治肝损伤。结论通过本研究可望进一步阐明LPS／TLR4在急性肝衰竭发病机制中的作用,为今后从RNA角度治疗肝功能衰竭提供理论和实验依据。     

地塞米松对内毒素休克大鼠脑皮质TLR4、IκBα和IL-18 mRNA表达的影响

目的：通过观察内毒素休克大鼠脑皮质中TLR4、IκBα和IL-18 mRNA的表达及地塞米松（Dex）对其的影响,探讨内毒素引起脑组织损伤的分子机制。方法：18只Wistar大鼠随机分为实验对照组（Control）、内毒素休克组（LPS）和地塞米松组（LPS+Dex）,每组6只。除对照组外,大鼠静脉注射内毒素（4 mg•kg^-1）,对照组大鼠静脉注射等量葡萄糖溶液;4 h后检测脑皮质中TLR4、IκBα和IL-18 mRNA的表达。结果：LPS+Dex组平均动脉压明显高于LPS组（P<0.01）,大鼠存活率亦明显高于LPS组（P<0.01）。LPS+Dex组TLR4、IL-18mRNA表达均明显低于LPS组（P<0.05）,而IκBα mRNA表达明显高于LPS组（P<0.05）。 结论：Dex能下调脑组织中TLR4 mRNA表达,而上调IκBα mRNA表达,对中枢神经系统具有一定的保护作用。