中国人丙型肝炎病毒基因组λgtll cDNA库的免疫筛选与鉴定

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是散发性及输血后肝炎的主要病原体,易致慢性肝炎、肝硬变或肝细胞癌。为了研究中国HCV基因组的变异及结构特征,我们从中国丙型肝炎(丙肝,Hepatitis C,HC)患者血浆中提取HCV基因RNA,用随机引物合成HCV cDNA并构建其λgtll cDNA库。对此基因库进行了免疫筛选,并对2个阳性克隆(Q349和Q653)在pUC18质粒中进行了亚克隆。序列分析结果表明:Q349和Q653分别来自HCV基因组核心(C)区(第554～902位)和非结构3(NS3)区(第4175～4827位)。Q349和Q653与HCV原型相应序列在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为86.8％,80.2％和97.3％,93.1％;与日本HCV相应序列间有更高的同源性,故属于HCVⅡ组。特异性灾验表明,Q349和Q653的编码多肽可与HC人群血清特异反应而不与正常人血清反应,且Q653与中国HC血清反应的阳性率(95.8％)比日本HC血清的阳性率(85.7％)高。表明根据中国HCV基因序列(特别是非结构区序列)设计引物或合成多肽将更适合中国人群HCV感染的检出。     

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段，获得其序列，并进行序列分析。方法：利用简并引物，进行RT-PCR，扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm-T载体，进行鉴定、测序；利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列，并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果：RT-PCR扩增出了-500bp左右的cDNA片段，对阳性克隆测序后获得其核酸序列，长498bp。推导出的氨基酸序列长166；氨基酸序列的同源性分析显示，该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性，组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论：本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱近酸蛋白酶cDNA片段。     

中国人丙型肝炎病毒囊膜蛋白2HVR1 cDNA的序列分析

目的：了解中国ＨＣＶ流行株高变区１（ＨＶＲ１）的特点。方法：对来自山东（ＳＤ）、上海（ＳＨ）两地患者血清ＲＮＡ进行逆转录－巢式ＰＣＲ，扩增ＨＣＶ囊膜蛋白２基因片段，用ＰＣＲ直接测序法对该片段进行序列测定。结果：（１）扩增片段（命名为Ｐ３８８）对应于日本ＨＣＶ－Ｊ株序列核苷酸１４３９￣１８２６位（氨基酸位３７１￣４９８）；（２）中国人ＨＣＶ ＨＶＲ１位于氨基酸位３８４￣４１０，与发表的ＨＣＶⅡ型ＨＶ     

丙型肝炎病毒2a型E2区基因cDNA的变异分析

目的 了解丙型肝炎病毒2a型基因组E2区序列的一级结构及变异特征，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能打下基础。方法 用逆转录套式多聚酶链反应(RT-nPR)法从1例NANB型肝炎患者血清中扩增出一条约1100bp的片段，以限制性内切酶EcoRI、HindⅢ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果 测得约1100bp的核苷酸序列，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV-1、HC-C2、HCV-BK、HC-J6、HC-J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为63．1％、64．2％、64．1％、86．9％、69．3％，在氨基酸水平上的同源性分别为69．6％、70．7％、69．6％、86．2％、83．1％。结论 分离株(HCV-JF)与HC-J6同属2a型。     

血液透析患者中TT病毒感染的检测及序列分析

目的：研究血液透析患中TT病毒（TTV）的感染状况及其致病性。方法：针对病毒基因保守区设计引物,采用套式PCR方法对69例血液透析患血清标本进行TTVDFNA检测及序列分析。并同时检测患血清丙氨酸转氨酶（ALT）及丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）。结果：患血清TTVDNA总阳性率为27.5%。对其中1例PCR扩增产物测序。结果与其他TVV分离株如GH1、TA278、TTVCHN1和TTVCHN2的核苷酸序列同源性为89%-100%,推测的氨基酸序列同源性为87%-100%。抗-HCV阳性与阴性患的TTV DNA阳性率无明显差异。所有患均未见ALT明显升高。结论：血液透析患存在较严重的TTV感染与HCV感染无明显相关性。未发现TTV感染导致ALT明显升高的证据。     

树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.     

杜氏盐藻RbcS基因cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆杜氏盐藻-，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(RuBisCO)小亚基RbcS cDNA片段。方法：根据莱茵衣藻、团藻、玉米等真核生物的RuBisCO小亚基RbcS氨基酸的高度保守序列ETRSYLPP和MNKLPMFG，设计一对简并引物，采用RT—PCR方法及该简并引物克隆杜氏盐藻RbcS cDNA。PCR产物经T—A克隆与T-vector相连，转化大肠杆菌JM109，随机挑取数个菌落，筛选鉴定，对阳性克隆进行测序分析。将测序结果推导成氦基酸序列进行同源性比较。结果：得到的cDNA长度为209bp，编码69个氨基酸。推导的氦基酸序列与团藻、Chloromonas sp．ANT3、衣藻、伞藻、菠菜、玉米的Rbc S相比较，同源性分刖为85％、84％、82％、76％、70％、69％。结论：所克隆的序列为杜氏盐藻RbcS DNA片段。     

应用酵母单杂交体系筛选与大鼠谷胱甘肽S—转移酶P增？…

目的 探讨谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ－Ｐ）基因表达调控机制的多样性及其与化学致癌的关系,筛选与大鼠ＧＳＴ－Ｐ增强子元件ＧＰＥⅠ相互作用的调控因子。方法 采用酵母单杂交体系重申选与ＧＰＥⅠ核心序列相互作用的转录激活因子,应用ＤＮＡ序列测定及计算机分析等手段对所测的ＤＮＡ序列进行分析。结果 共获得两个阳性克隆ｐＹＧＰＥ１和ｐＹＧＰＥ２。ＤＮＡ测序分析表明：ｐＹＧＰＥ１的插入片段与大鼠原癌基因ｃ－ｊｕｎ     

Expression of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus in HepG2 cell line

AlthoughthegenomeofseveralstrainsofhepatitisCvirus(HCV)havebeenclonedandscquenced,theHCVparticleshavenotbeenobservedsofar.Currently,becauseofverylowInfectionefficiency,oneofthemajorimpedimentstothestructuralanalysisofHCVgenomeandgeneticanalysisofviralreplicationisthelackofareliablecellculturesystempermissiveforH(IVreplicanon.Inthisstudy,usingrecomblnantDNAtechnlque,weconstructedarecombinantplasmidbysubcloningcoregenecDNAofChineseH(7VisolateIntoaeukaryoticexpressionvectorPTM3andexpres…