STAT1对hsp90α基因表达的负调控作用

目的探讨转录因子STAT1对hsp90α基因表达的调控作用.方法将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT-PCR定量检测其内源性hsp90α基因mRNA水平.共转染STAT1表达质粒和hsp90α基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因质粒,利用定量RT-PCR检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析方法检测42℃1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析(EMSA)检测STAT1与hsp90α5′基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度.结果STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90α基因的表达,又能抑制hsp90α基因5′上游调控区驱动的CAT报告基因活性.热激以前Jurkat细胞中的STAT1701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90α基因5′上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合.结论STAT1对hsp90α基因的表达具有负调控作用.     

STAT1对hsp90∝基因表达的负调控作用

目的 探讨转录因子STAT1对hsp90∝基因表达的调控作用。方法 将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT－PCR定量检测其内源性hsp90∝基因mRNA水平。共转染STAT1表达质粒和hsp90∝基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因质粒,利用定量RT－PCR检测CAT报告基因转录水平,用Western印迹分析方法检测42℃ 1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析（EMSA）检测STAT1与hsp90∝5‘基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度。结果 STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90∝基因的表达,又能抑制hsp90∝基因5‘上游调控区驱动的CAT报告基因活性。热激以前Jurkat细胞中的STAT1 701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90∝基因5‘上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合。结论 STAT1对hsp90∝基因的表达具有负调控作用。     

PLA激活JNK信号通路促进NCI-H292细胞凋亡

目的 探讨多聚左旋精氨酸(PLA)诱导NCI-H292细胞凋亡的信号通路及分子机制.方法 将加入PLA 的浓度梯度分5组:0、10、20、40、60 mg/L,作用NCI-H292细胞24 h后Western blot法检测每组c-Jun氨基末端激酶( JNK)的磷酸化水平;设对照组、PLA 组(40 mg /L)、SP组(加入特异性JNK通路抑制剂SP600125)、PLA+SP组,加药24 h后流式细胞仪检测每组NCI-H292细胞凋亡率,Western blot法检测各组NCI-H292细胞内凋亡相关蛋白 Bcl-2/Bax、Caspase-3、P-JNK/JNK和β-actin蛋白的表达水平.结果 对照组、PLA组、SP组、 PLA+ SP组 NCI-H292细胞凋亡率分别为(5.13 ±1.07)%、(22.62 ± 1.66)%、(5.69 ± 0.14)%、(8.99 ± 3.73)% ;Western blot 法检测 PLA 诱导 NCI-H292 细胞内BCL-2/Bax比值降低( P＜0. 01),Caspase 3 表达升高( P＜0. 001),PLA诱导NCI-H292 细胞JNK 磷酸化水平增加(P＜0.001 ), SP600125 抑制 PLA 诱导 JNK 磷酸化( P ＜0.001).结论 PLA可能介导JNK信号通路引起NCI-H292细胞凋亡水平增加.     

小脑颗粒神经元撤钾凋亡中JNK/c-Jun通路对促凋亡基因Hrk的转录调控

目的研究小脑颗粒神经元(CGNs)撤钾凋亡模型中,BH3-only促凋亡基因Hrk的转录,及JNK/c-Jun通路对Hrk基因转录的调控。方法新生7 d Sprague-Dawley大鼠CGNs在含10%胎牛血清和25 mmol/L KCl培养液中培养。培养第7天,分别用不含胎牛血清的25或5 mmol/L KCl培养液处理2、4、8 h,或5 mmol/L KCl+JNK通路抑制剂处理细胞4 h;或在培养第5天用表达负显性c-Jun突变体的腺病毒载体(Ad-FLAGΔ169)感染CGNs 36 h后,用5mmol/L KCl处理细胞4 h。用RT-PCR方法检测各组CGNs促凋亡基因Hrk mRNA的表达。结果在CGNs撤钾凋亡模型中促凋亡基因Hrk mRNA转录上调;JNK通路抑制剂CEP-11004或SP600125均部分地下调了Hrk的转录;负显性c-Jun突变体抑制了Hrk mRNA的表达。结论在CGNs撤钾凋亡模型中促凋亡基因Hrk转录上调;JNK/c-Jun信号通路介导了Hrk的转录。     

BTB/POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp900α基因表达的增强作用

目的 探讨人BTB/POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90α基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90α基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomalvector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90α-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90α-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp900α CAT的表达。     

BTB／POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90a基因表达的增强作用

目的 探讨人BTB／POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90a基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90a基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90a-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a CAT的表达。     

hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录

目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.     

JNK信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮的干预作用

目的：探讨c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮（PGZ）的干预作用.方法：采用游离脂肪酸（FFA）诱导小鼠βTc3细胞凋亡;以MTT法观察FFA对细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞化学和Western Blot法检测在FFA、特异性JNK抑制剂SP600125及PGZ作用下磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化c-jun（p-c-jun）的表达.结果：FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,JNK阻断剂及PGZ可显著减少这一过程引起的凋亡;且FFA诱导βTc3细胞凋亡伴随着JNK信号通路中p-JNK和p-c-jun的升高;用SP600125预处理细胞后,可明显减少p-JNK和p-c-jun的活化;而PGZ未能抑制FFA引起的JNK活化.结论：JNK信号通路参与了FFA诱导的小鼠βTc3细胞凋亡;PGZ可明显抑制胰岛βTc3细胞凋亡,但这一过程可能没有通过JNK信号通路.     

JNK／c-Jun 信号通路参与介导 EB 病毒编码的BARF1基因上调胃癌细胞 Bcl-2的表达

目的:探讨EB病毒编码的BARF1基因对胃癌细胞JNK-MAPK信号通路活性及Bcl-2基因表达的影响。方法:以p SG5空载体转染的胃癌细胞系BGC823(BGC-SG)为对照,采用蛋白质印迹分析稳定表达BARF1的BGC823细胞(BGC-BARF1)中,以及采用JNK-MAPK的特异性抑制剂SP600125处理后JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平以及cJun和Bcl-2蛋白的表达。结果:与BGC-SG相比,BGC-BARF1细胞中JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平,以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表达均显著提高(P<0.05)。SP600125处理后,c-Jun蛋白的磷酸化水平以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表达均显著下降。结论:JNK/c-Jun信号通路参与介导BARF1上调胃癌细胞中Bcl-2的表达。     

丙丁酚抑制氧化型低密度脂蛋白诱导系膜细胞转化生长因子-β1表达

目的观察丙丁酚对ox-LDL诱导系膜细胞AP-1活性和TGF-β1表达的作用,探讨抗氧化剂治疗脂质肾损伤的分子机制.方法大鼠系膜细胞随机分为正常细胞组、ox-LDL处理组和ox-LDL+丙丁酚处理组.运用凝胶迁移率实验检测AP-1活性变化,Western杂交检测c-Jun、JNK/SAPK磷酸化及TGF-β1蛋白表达水平的改变.运用Northern杂交检测TGF-β1 mRNA表达.结果丙丁酚50 μmol/L预处理系膜细胞20 h,显著降低ox-LDL诱导系膜细胞AP-1活性.丙丁酚浓度为50、100、200 μmol/L时,均显著抑制ox-LDL诱导JNK,/SAPK磷酸化;且ox-LDL+丙丁酚处理组的c-Jun蛋白表达分别为ox-LDL处理组的60%、51%和46%.Northern杂交显示ox-LDL为10 μg/mL时并不激活TGF-β1 mRNA表达(P>0.05);而当ox-LDL浓度增至50、100 μg/mL时,TGF-β1 mRNA表达分别增加1.8和1.9倍.Western杂交显示ox-LDL呈剂量依赖方式增加TGF-β1蛋白质表达.加入丙丁酚后显著降低ox-LDL诱导系膜细胞的TGF-β1 mRNA和蛋白质表达(P<0.05).结论丙丁酚可能通过抑制JNK1/SAPK磷酸化和AP-活性下调ox-LDL诱导系膜细胞TGF-β1表达.     

丝裂原活化蛋白激酶信号途径在热休克蛋白90基因表达？…

目的 研究丝裂原活化蛋白激酶－（ＭＡＰＫ）信号传导途径对Ｊｕｒｋａｔ细胞中热休克蛋白９０基因（ｈｓｐ９０）表达的影响。方法 用Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹－增强型化学光系统（ＥＣＬ）检测热休克前后Ｊｕｋａｔ细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ）、ｐ３８激酶及ｃ－Ｊｕｎ Ｎ－末端蛋白激酶（ＪＮＫ）的底物ｃ－Ｊｕｎ的磷酸化程度;分别用ＪＮＤ１的显性负突变质粒ＤＮ－ＪＮＫ１、ｐ３８ｃＤＮＡ反应表达质粒ａｎｔｉ－ｐ３８及     

热休克诱导基因表达谱的变化

目的 研究细胞在热应激时的基因表达谱变化。方法 提取热休克前后Jurkat细胞的总RNA,经逆转录合成cDNA探针后分别与人cDNA表达占阵杂交,再用ESTblot软件进行分析,并用Northern印迹证明基因表达的改变。结果 经42℃1h热休克的细胞中有40个基因的mRNA表达升高,16个基因的mRNA表达降低,其中除热休克基因表达显著增加外,原癌基因c-Jun、cdc样激酶CLK－1基因表达明显增加。整合素integrin ∝－4基因,转化生长因子TGF－β基因表达显著降低。Northern印迹证明c-Jun及hsp90∝基因表达升高。结论 在热应激条件下Jurkat细胞热休克基因、c-Jun、CLK－1基因表达增加,integrin ∝－4基因、TGF－β基因表达减少。     

人hsp90β基因的诱导表达与染色质活化的关系

目的 研究人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达与染色质活化的关系。方法 采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Ｊｕｒｋａｔ细胞内的活性和非活性染色质。然后采用狭缝杂交技术比较热诱地前后人ｈｓｐ９０β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交的方法研究热休克诱导下的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。结果 发现热休克诱导使细胞内人ｈｓｐ９０β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的ｈｓｐ９０β     

维生素D3,9—顺式维甲酸及其相应核受体对hsp90β基因？…

目的 研究维生素Ｄ３（ＶＤ３）、９－顺式维甲酸（９－ｓｉｃ－ＲＡ）及其相应核受体对ｈｓｐ９０β基因表达的调控作用。方法 采用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ方法将人ｈｓｐ９０β基因调控片段（－１ ０３９ ｂｐ／＋１ ５３１ ｂｐ）介导的荧光素酶（Ｌｕｃ）报告基因质粒β１．１１转染Ｊｕｒｋａｔ细胞,并用ＶＤ３和９－ｃｉｓ－ＲＡ分别或同时刺激细胞,或将质粒β１．１１及野生型维生素Ｄ３受体（ＶＤＲ）或／和维甲酸     

检测4种热休克基因表达水平的RT-PCR体系的建立及其应用

目的建立能同时检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA表达水平的RT-PCR体系。方法采用基因克隆、基因重组、体外转录、RT-PCR技术,建立能同时检测细胞中4种热休克基因的RT-PCR体系,并将此体系用于检测SW13细胞中热休克基因的表达。结果构建了用于4种热休克基因mRNA检测的内参照质粒,并经体外转录成内参照RNA(i-RNA);用于SW13细胞中结果显示:hsp70、hsp90α呈典型的热诱导表达,hsp60和hsp90β具有较高水平的组成性表达,并且呈不同程度的热诱导表达。结论新构建的RT-PCR体系可以用于检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA的表达水平。     

慢性寒冷应激诱导大鼠肝脏损伤及其机制

目的：研究寒冷应激对大鼠肝脏损伤的诱导作用及其分子机制.方法：将雄性SD大鼠置于（-15±1）℃自动控温低温实验舱内每日进行冷暴露6h,按照寒冷应激暴露时间的不同分为1,3,5,7,10,14d组.取各组大鼠肝脏组织石蜡切片,采用HE染色观察不同寒冷暴露时间下对大鼠肝脏的损伤程度.采用Western Blot方法检测大鼠肝脏组织c-Jun氨基末端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（ERK）信号分子的表达及磷酸化水平.结果：寒冷应激对大鼠肝脏可产生明显的损伤作用,冷应激7d时肝脏损伤有暂时性恢复,但随后再次加重.寒冷应激后肝组织JNK1/2（p-JNK1/2）磷酸化水平显著增高,而且这种增高与肝组织细胞损伤程度存在显著的相关性,但ERK1/2的表达及磷酸化水平没有明显的改变.结论：寒冷应激可以引起大鼠肝脏的损伤,肝脏组织JNK1/2的磷酸化水平的增高可能是其重要分子机制之一.     

Study on the Relationship between Heat Shock Protein 70 and Toll-like Receptor-4 of Monocytes

TolllikereceptorsarethehumanhomologueoftheDrosophilaTollprotein.TheybelongtotheIL1receptorfamilycontainingrepeatedleucinerichmotifsintheirextracellularproteinandarelinkedtoasignalingpathwaythatinvolvestheIL1receptorassociatedkinaseandNFκB.Recentstudieshavesuggestedthatautologousheatshockprotein70(hsp70)servesasadangersignaltotheinnateimmunesystem[1].Interestingly,microbialhsp70alsoinducesaproinflammatoryresponseininnateimmunecells,suggestingthatdamagedautologouscellsandmincrobialpathogens…