MiR205在脓毒症小鼠心脑肾中对HMGB1表达的影响

目的:检测在胆碱能抗炎通路(CAP)中miR-205表达变化和对脓毒症小鼠脑、心、肾组织中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的调节作用。方法:15只BALB/C小鼠被随机分成3组:脓毒症组和CAP组各6只,对照(control)组3只,分别腹腔注射脂多糖(LPS)15mg/kg+生理盐水,LPS 15mg/kg+GTS-21 4mg/kg,等量生理盐水。24h后处死小鼠取材心、肾、脑组织。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脓毒症小鼠和胆碱能抗炎通路小鼠的脑、心、肾组织中miR-205与HMGB1的表达。结果:脓毒症小鼠脑、心、肾组织的miR-205表达与对照组相比无明显变化(P_2、P_4、P_6>0.05),CAP组均较其他两组明显升高(P_1、P_3、P_5<0.001)。脑、肾组织中HMGB1的表达CAP组较脓毒症组有明显降低(P_1、P_3<0.001)。心肌组织中HMGB1的表达在脓毒症组和CAP组差异无显著性(P5>0.05)。结论:激活胆碱能抗炎通路时,脑、心、肾组织中表达升高的miR-205降低脑、肾组织中HMGB1的表达。     

胆碱能抗炎通路对脓毒症大鼠早期炎症与免疫反应具有负向调控作用

目的 通过对特异性胆碱能受体α7nAChR进行干预,探讨胆碱能抗炎通路（CAP）在脓毒症早期对炎症与免疫的调控。方法 采用SPF级SD大鼠64只,用随机数字表法分组,对照组8只：正常饲养,不做任何处理;假手术组8只：大鼠剖腹但不进行盲肠结扎穿刺法（CLP）制备脓毒症模型,并予哌拉西林（50 mg/kg,腹腔注射,3次/d,连续3 d）;脓毒症组共48只,采用CLP脓毒症模型制备,制备成功后随机分为模型组16只：予哌拉西林（50 mg/kg,腹腔注射,3次/d,连续3 d）及生理盐水（1 mL/100 g,腹腔注射,3次/d,连续3 d）;GTS-21组16只,哌拉西林使用同脓毒症组,并以GTS-21（4 mg/kg,腹腔注射,1次/d,连续3 d）进行干预;甲基牛扁亭（MLA）组16只：哌拉西林使用同脓毒症组,并以MLA（4.8 mg/kg,腹腔注射,1次/d,连续3 d）进行干预。记录各组大鼠MSS评分并进行短程HRV分析,3 d后处死大鼠采集血液,采用ELISA测定血清TNF-α、IL-1α、IL-10、IL-6、HMGB1、sCD14等细胞因子、采用细胞流式方法测定淋巴细胞CD4+CD25+ Treg与TH17阳性细胞比例。结果 与对照组比较,脓毒症大鼠MSS 评分明显升高,HRV指标（SDNN, RMSSD, HF, SD1, SD2）明显下降（P<0.05）;GTS-21明显改善了脓毒症MSS评分（P<0.05）,MLA较GTS-21明显增加MSS评分（P<0.05）,二者对HRV指标无显著影响（P>0.05）;脓毒症大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-10、IL-6、HMGB1、sCD14浓度、淋巴细胞CD4+CD25+ Treg与TH17淋巴细胞明显升高（P<0.05）,Treg/TH17较对照组明显降低（P<0.05）,GTS-21能明显降低脓毒症血清TNF-α、IL-1α、IL-6、HMGB1、sCD14浓度及TH17淋巴细胞百分比（P<0.05）;MLA增加脓毒症 大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-10、IL-6、HMGB1、sCD14浓度与CD4+CD25+ Treg,TH17淋巴细胞百分比、降低模型组大鼠Treg/TH17,与GTS-21组相比有显著差异（P<0.05）。结论 CAP对脓毒症早期炎症与免疫反应具有明显的负向调控作用,HRV部分指标能较好的反应CAP对炎症与免疫的调控效能。     

LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验研究

目的:观察LPS诱导RAW264.7细胞内HMGBl转位及其释放.方法:用不同浓度的LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h,用荧光显微镜观察LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1的分布情况.用West-ern blot方法检测HMGB1在胞核及培养上清中的水平.结果:LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h后,培养上清中的HMGB1水平明显增加,胞核HMGBl含量减少,并存在剂量依赖关系.结论:LPS能诱导RAW264.7细胞释放HMGB1,存在剂量依赖关系.     

COX/5-LOX双重抑制剂ZLJ-6对脂多糖诱导下巨噬细胞炎症因子表达的影响

研究COX/5-LOX双重抑制剂ZLJ-6对脂多糖(LPS)诱导下RAW 264.7细胞炎症模型的抗炎作用。采用LPS (1μg/mL)刺激生长良好的RAW 264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型,在不同浓度的ZLJ-6( 3,10,30 μmol/L)作用下,用Griess法检测细胞培养液中NO的含量,用ELISA法检测TNF-α、IL-6含量,并用Western blotting检测各组细胞中环加氧酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮激酶(iNOS) 的表达。ZLJ-6能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的释放以及TNF-α、IL-6等炎症因子的生成,同时抑制COX-2和iNOS的表达。结果表明,ZLJ-6具有抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的作用,其抗炎机制可能通过抑制COX-2、iNOS的表达以及炎症介质NO以及TNF-α、IL-6的产生。     

苦柯胺B拮抗细菌内毒素和CpG DNA的实验研究

目的观察中药活性成分苦柯胺B(kukoamine B,KB)体内外拮抗脓毒症的药理活性。方法采用双偏振极化干涉测量技术测定KB与大肠埃希氏菌LPS、CpG ODN 1826的亲和力,并用鲎试剂法检测KB对大肠埃希氏菌LPS的体外中和作用,采用ELISA法体外检测KB对LPS和CpG DNA单独刺激RAW 264.7细胞释放炎症介质TNF-α和IL-6的抑制作用,ELISA法检测热灭活大肠埃希菌和热灭活金黄色葡萄球菌刺激RAW 264.7细胞释放炎症介质TNF-α和IL-6的抑制作用。在腹腔注射热灭活细菌菌液小鼠脓毒症模型中,将BALB/c小鼠分为对照组、KB(低、中、高剂量)组、和临床药物组(血必净和乌司他丁),观察比较7 d内各组动物死亡率。结果 KB与LPS和CpG ODN1826的KD值分别为7.38 nmol/L和197.2 nmol/L,在体外KB能够明显抑制LPS对鲎试剂的促凝作用(P<0.05,P<0.01),对热灭活细菌刺激RAW 264.7细胞释放TNF-α和IL-6具有显著的抑制作用,并呈现明确的量效关系(P<0.05,P<0.01)。在体内实验中,KB对重度和极重度脓毒症模型均具有明确的保护作用,KB组小鼠生存率显著高于对照组和临床药物组(P<0.05,P<0.01)。结论 KB作为一种多病原分子的中和剂,能够抑制炎症介质的释放,发挥对脓毒症模型小鼠的保护作用,且效果显著优于现有临床用药血必净和乌司他丁。     

Antagonistic effect of kukoamine B on bacterial endotoxin and CpG DNA

目的 观察中药活性成分苦柯胺B( kukoamine B,KB)体内外拮抗脓毒症的药理活性.方法 采用双偏振极化干涉测量技术测定KB与大肠埃希氏菌LPS、CpG ODN 1826的亲和力,并用(尝)试剂法检测KB对大肠埃希氏菌LPS的体外中和作用,采用ELISA法体外检测KB对LPS和CpG DNA单独刺激RAW 264.7细胞释放炎症介质TNF-α和IL-6的抑制作用,ELISA法检测热灭活大肠埃希菌和热灭活金黄色葡萄球菌刺激RAW 264.7细胞释放炎症介质TNF-α和IL-6的抑制作用.在腹腔注射热灭活细菌菌液小鼠脓毒症模型中,将BALB/c小鼠分为对照组、KB(低、中、高剂量)组、和临床药物组(血必净和乌司他丁),观察比较7d内各组动物死亡率.结果 KB与LPS和CpG ODN1826的KD值分别为7.38 nmol/L和197.2 nmol/L,在体外KB能够明显抑制LPS对鲎试剂的促凝作用(P＜0.05,P＜0.01),对热灭活细菌刺激RAW 264.7细胞释放TNF-α和IL-6具有显著的抑制作用,并呈现明确的量效关系(P＜0.05,P＜0.01).在体内实验中,KB对重度和极重度脓毒症模型均具有明确的保护作用,KB组小鼠生存率显著高于对照组和临床药物组(P ＜0.05,P＜0.01).结论 KB作为一种多病原分子的中和剂,能够抑制炎症介质的释放,发挥对脓毒症模型小鼠的保护作用,且效果显著优于现有临床用药血必净和乌司他丁.     

丙型肝炎病毒高变区1模拟表位7肽对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子影响的研究

目的观察丙型肝炎病毒（HCV）高变区1（HVR1）模拟表位7肽（7P）对内毒素/脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核/巨噬细胞株（RAW264.7）细胞释放细胞因子的影响。方法体外培养小鼠RAW264.7细胞,用LPS刺激小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6,用不同浓度（5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0μg/mL）的7P进行干预,应用单溶液细胞增殖（MTS）法检测7P对细胞活力的影响,应用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测细胞培养上清中促炎细胞因子的含量。结果 7P可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6,并呈一定的量效关系,其影响细胞因子释放作用与细胞毒作用无关。结论 7P呈浓度依赖性地抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6。     

Erbin蛋白在GTS-21激活胆碱能抗炎通路中的调控作用

目的:探讨Erbin蛋白在GTS-21激活胆碱能抗炎通路抑制胞壁酰二肽(MDP)诱导的炎症反应中的调控作用。方法:将正常培养的RAW264.7细胞分为4组:空白对照组(NS组),MDP组(M组):MDP(10μg/ml),GTS-21组(G组):MDP(10μg/ml)+α7nAChRs特异激动剂/GTS-21(50μg/ml),Erbin shRNA干扰组(R组):MDP(10μg/ml)+GTS-21(50μg/ml)+Erbin shRNA。在MDP刺激后1,6,24h时间点提取标本,每个时间点10个样本。Western检测Erbin的表达,免疫荧光检测Erbin的免疫定位,凝胶迁移率实验(EMSA印迹)检测NF-κB活化,ELISA检测TNF-α、IFN-γ等促炎性细胞因子水平。结果:MDP刺激后,Erbin表达升高,NF-κB活性增强,TNF-α、IFN-γ水平显著增加;与M组相比,G组Erbin表达明显升高(P<0.05),NF-κB活性降低(P<0.05),TNF-α、IFN-γ水平均下降(P<0.05),与G组相比,R组Erbin表达明显下降(P<0.05),NF-κB活性增强(P<0.05),TNF-α、IFN-γ水平均升高(P<0.05)。结论:Erbin蛋白是激活胆碱能抗炎通路抑制MDP诱导的炎症反应中关键调控蛋白,起负调控作用。     

硫酸镁对脂多糖诱导巨噬细胞表达和释放高迁移率族蛋白1的影响

目的 探讨硫酸镁对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7表达和释放高迁移率族蛋白1( HMGB1)的抑制作用.方法 传代培养的小鼠RAW264.7细胞分5组接种于6孔板,每组为3孔.C组为仅加RPMI 1640培养液的对照组,LPS组为在RPMI 1640培养液的基础上加500 ng/mL LPS的诱导组,M1组为在LPS组基础上加1 mmol/L硫酸镁的干预组,M5组为在LPS组的基础上加5 mmol/L硫酸镁的干预组,M10组为在LPS组基础上加10 mmol/L硫酸镁的干预组.孵育24 h后,收集细胞及细胞培养上清液,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测各组细胞内HMGB1 mRNA表达水平和细胞培养上清液中HMGB1蛋白含量的变化.结果 M1、M5、M10组的RAW264.7细胞活性分别为1.35±0.10、1.34±0.11、1.31±0.08,差异均无统计学意义(P值均＞0.05).LPS、M1、M5、M10组细胞上清液中HMGB1蛋白的含量分别为(82.80±9.15)、(81.26±8.47)、(56.69±6.21)、(50.71±6.62)ng/mL,均显著高于C组(C组为0,P值均＜0.05);M5、M10组细胞上清液中HMGB1蛋白的含量均显著低于LPS及M1组(P值分别＜0.05或0.01).LPS、M1、M5、M10组细胞中HMGB1 mRNA的相对表达量分别为1.435±0.161、1.416±0.124、0.873±0.093、0.774±0.067,均显著高于C组的0.195±0.020(P值均＜0.05);M5、M10组细胞中HMGB1 mRNA的相对表达量均显著低于LPS及M1组(P值分别＜0.05或0.01).结论 硫酸镁抑制LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGB1,通过抑制与脓毒症致死性密切相关的关键炎性因子,可能对脓毒症患者具有一定保护作用.     

毛樱桃总黄酮对RAW264.7细胞中炎症因子水平的影响及其机制

目的：探讨毛樱桃总黄酮（PTTTF）对脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症模型中炎症因子的影响,阐明其作用机制。方法：通过LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7和人中性粒细胞（PMN）建立细胞炎症模型,将细胞分为对照组、模型组、地塞米松（DXM）组和不同剂量（0.4、4.0和40.0 mg·L^-1）PTTTF组。采用RT-PCR法检测RAW264.7细胞中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA表达水平;采用Western blotting法检测RAW264.7细胞中核转录因子κB（NF-κB）及信号通路关键分子细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）、C-Jun氨基末端激酶1/2（JNK）和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达水平;采用流式细胞术检测RAW264.7细胞S期细胞百分率和PMN细胞凋亡率。结果：与对照组比较,模型组RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α和HMGB1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,S期细胞百分率明显升高（P<0.05）,PMN细胞凋亡百分率明显降低（P<0.05）。与模型组比较,4.0及40.0 mg·L^-1PTTTF组和DXM组RAW264.7细胞中IL-1β、iNOS、TNF-α和HMGB1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）,NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,S期细胞百分率明显降低（P<0.05或P<0.01）,PMN细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：PTTTF能够下调LPS诱导的细胞炎症模型中炎症因子表达水平,该作用可能与其降低S期细胞百分率,促进其凋亡,并下调NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达有关。