人胆固醇酯水解酶基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建含有人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因的慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH-IRES-EGFP,为hCEH基因治疗缺血性脑卒奠定基础。方法应用聚合酶链反应方法扩增目的片段,在目的基因进行上、下游分别加上PacI和AscI两个酶切位点,经双酶切后,转化入感受态DH5d细胞中,通过筛选获得重组质粒。将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果目的基因与慢病毒表达载体pLenti6．3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP构建与预期相匹配,包装细胞293T呈绿色荧光。结论成功构建了携带hCEH基因的慢病毒载体。     

NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的 构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况.方法 采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLemi6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选最适MOI,以最适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率.Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平.结果 成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3 -NK4 -IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL.重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI为7.转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达.结论 成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白.     

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定

[目的]构建带有大鼠HIF-1α基因的慢病毒表达载体,并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染.[方法]从pEGFP-N1-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将目的基因与pLenti6.3-MCS-RES2-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,并用磷酸钙转染法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,48h后收集上清液并过滤,按不同感染复数感染293T细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率.[结果]构建了共表达HIF-1α基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,经PCR及测序结果证实,并对其成功包装出慢病毒,病毒滴度为4×106TU/ml.[结论]成功构建出HIF-1α基因重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP并能有效的包装出慢病毒.     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

人肝再生增强因子基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)基因的慢病毒表达载体,并验证其安全性与有效性.方法 将以人胎肝cDNA为模板扩增得到的ALR与pLenti6/V5-D-TOPO重组慢病毒载体连接后,与慢病毒包装体系ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞,得到携带人ALR基因的慢病毒表达载体病毒颗粒,实时定量PCR法测定病毒滴度;转染BLR 3A大鼠肝细胞,观察细胞生长情况,并用RT-PCR法测定ALR基因表达的方法,验证构建的慢病毒载体的安全性与有效性.结果 扩增产物凝胶电泳、提抽质粒酶切电泳及基因测序结果均显示成功构建携带ALR基因的慢病毒表达载体,测得其病毒滴度为1.48×107 v.p./mL.转染BLR 3A大鼠肝细胞72 h后,仅少量细胞病变脱离,转染率为88.49％;RT-PCR结果显示,构建的携带ALR慢病毒表达载体可诱导BLR 3A大鼠肝细胞表达ALR基因.结论 慢病毒表达载体是一种兼具有效性与安全性,且适用于基因研究的病毒表达载体.     

针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人神经源性分化蛋白基因(NeuroD)RNA干扰慢病毒表达载体。方法 根据已公布的NeuroD基因序列(GenBank:NM_002500),设计并合成4 对shRNA(NeuroD1~D4),与载体pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD 表达载体,转化入感受态细胞DH5α; real-time PCR 技术检测pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛选出的干扰载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1与慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST经酶切后连接,构建慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(Packaging Mix)共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。采用PCR法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果 成功构建针对靶基因的4个干扰质粒,测序结果表明,4个pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体序列与参考序列一致,real-time PCR 检测显示以pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1的沉默效应最佳(P<0.01)。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR转染至293T细胞株,酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期一致,病毒滴度达1.18×108 ifu/mL。结论 成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

大鼠pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体的构建与包装

目的构建大鼠少突胶质细胞转录因子1(Olig1)的慢病毒表达载体,并进行鉴定和包装。方法采用聚合酶链反应(PCR),分别以大鼠pEGFP-N3-Olig1表达质粒和pDsRed-monomer-N1为模板,扩增获得大鼠Olig1片段和红色荧光蛋白(RFP)片段。将两者进行PCR拼接获得Olig1-RFP片段,并与pLenti6.3-MCS-DEST载体连接,构建获得pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体,并进行酶切鉴定、测序。然后,将其与包装质粒混合后共转染HEK293T细胞进行包装获得慢病毒颗粒。结果通过酶切鉴定、测序,证明pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体构建成功,且能够被高效地包装为病毒颗粒。结论成功建立大鼠pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达系统,为进一步研究Olig1的生物学作用提供了实验基础。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

人notch1—shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建人notch1—shRNA慢病毒表达载体,为Notch信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pENTR／U6质粒,通过与pLenti6／BLOCK—iT—DEST载体的LR重组,构建notch1—shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导人293FT细胞,包装成慢病毒。用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SH—SY5Y细胞,RT-PCR和Westernblot法检测细胞notch1基因的表达。结果目的序列成功连接于载体并包装成较高滴度的慢病毒,细胞mRNA和蛋白质的检测均表明构建的notch1—shRNA慢病毒表达载体LR-ND-A能显著抑制SH-SY5Y细胞notch1基因的表达。结论成功构建人notch1—shRNA慢病毒表达载体。     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。