大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法。研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定MSCs生长曲线；并应用流式细胞术测定细胞周期和表面标记物。结果MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上；细胞周期显示有91．4％处于G0／Gl期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45。结论在实验条件下，体外培养8代以前的MSCs生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，可作为组织工程的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性.方法 30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组.各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究.结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原.全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代.结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似.     

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究

[目的]建立从大鼠骨髓中分离大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stemcells,r MSCs)和体外传代培养技术,并对r M-SCs的生物学特性进行研究。[方法]采用贴壁筛选法分离r MSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养,绘制1、3、5代细胞生长曲线,用流式细胞仪检测其表面抗原,并比较在含不同浓度胎牛血清培养液培养后r MSCs的生长、增殖情况。[结果]r MSCs在体外培养扩增,原代可获得(5~6)×105、第5代可获得(2~3)×108个细胞。r MSCs形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,流式细胞仪检测结果显示,r MSCs表面抗原CD90表达阳性,而CD45表达阴性。[结论]所建立的分离和培养方法获取的是r M-SCs,具有r MSCs生物学特性,是组织工程研究中良好的细胞来源。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

全骨髓接种培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

[目的]研究全骨髓接种培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,及获取的MSCs的生物学特性.[方法]用全骨髓接种和贴壁培养法获取、纯化、扩增Sprague Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞.倒置相差显微镜动态观察培养细胞的生长、形态、排列变化.取第3代MSCs,用台盼蓝拒染法检测细胞的活力,Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞增殖能力并绘制生长曲线图,用成骨和成脂诱导分化实验检测MSCs的多向分化能力.[结果]骨髓间充质干细胞具有贴壁生长特性,通过换液、传代的方法可去除悬浮细胞和纯化细胞,传代细胞生长快于原代细胞.MSCs呈长梭形或多角形,胞体上有不规则突起.排列成漩涡状或鱼群状.全骨髓接种培养法获取的MSCs高表达骨髓间充质干细胞表型(CD29、CD44),造血细胞标记(CD45、CD11b)表达率低,细胞活力好、凋亡率低,具有较强的增殖能力及成骨、成脂分化能力.[结论]全骨髓接种加贴壁法培养MSCs方法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好,且具备多向分化能力的骨髓间充质干细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞的无血清培养与鉴定

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、培养、扩增及鉴定方法,为MSCs后续研究提供种子细胞。方法采用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合分离纯化MSCs并传代,在无血清组和有血清组培养基DMEM/F12中培养,传代扩增。倒置相差荧光显微镜下观察两组细胞生长特性和形态,采用MTT(噻唑蓝)法检测增殖水平并绘制生长曲线,检测两组细胞周期。分别取两组细胞第三代MSCs,采用流式细胞仪检测细胞表型。结果无血清组培养基培养9~10 d有明显的细胞丛生长,略晚于有血清组的7~8 d;MTT测定生长曲线显示两组细胞增殖能力相似;流式细胞仪检测两组培养方式下细胞均表达CD29、CD54,不表达CD34、CD45;细胞周期检测显示无血清组G0/G1期细胞为68.0%,明显高于有血清组的46.4%,两组差异有显著性。结论无血清培养基的条件能较好地使细胞处于G0/G1期,保持更好的分化潜能及干细胞特性。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法，并对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法：分离5～8周龄的大鼠股骨骨髓进行体外培养，取5代以后的MSCs观察形态特征，绘制生长曲线，进行细胞化学染色，并用流式细胞仪检测其表面标志和进行细胞周期分析。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为30h，细胞化学染色显示碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、苏丹黑B(SB)阴性，而*醋酸萘酚醋酶(α-NAE)与糖原(PAS)阳性，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90表达阳性，而CD34、CD38、CD45表达阴性；细胞周期分析显示，G0／G1期：79．48％，G2／M期：6．10％，S期：14．42％。结论：本方法分离纯化出的是MSCs，其在体外具有生长稳定，增殖较快的特点，是组织工程研究中良好的细胞来源，也是转基因研究优良的载体细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。