应用二维电泳和质谱技术筛选乳腺癌相关差异表达蛋白质的初步研究

目的:通过分离并鉴定乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织的差异表达蛋白质,以发现可能用于早期诊断的乳腺癌肿瘤标志物.方法:提取人乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织的总蛋白质,用双向电泳分离蛋白并进行比较.选择在乳腺癌组织中明显差异表达的蛋白点,行质谱分析.结果:获得了分辨率和重复性均很好的凝胶蛋白图谱.对筛选出的在乳腺癌组织中明显差异表达的20个蛋白点,共有13个蛋白点被成功鉴定,其中在乳腺癌组织巾高表达的为8个,低表达的为5个.结论:乳腺癌组织相对于癌旁、正常乳腺组织蛋白存在明显的差异,过蛋白质组学方法筛选并鉴定出的这些蛋白质可能成为用于早期诊断和评价预后的乳腺癌标志物.     

肺癌相关蛋白的筛选与鉴定

目的:应用蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白,为阐明肺癌发生的分子机制和预后研究提供理论依据. 方法: 收集8例手术切除的新鲜肺癌组织及同一患者手术切缘的癌旁组织,提取可溶性总蛋白. 应用等电聚焦(IEF)电泳和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰凝胶电泳(SDS-PAGE)技术将可溶性总蛋白分离,得到肺癌的蛋白质组分析型双向电泳图谱,经PDQuest凝胶图像分析软件分析后找出差异蛋白点. 胶内酶解差异表达的蛋白点,基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),搜寻蛋白质数据库,并运用生物信息学鉴定蛋白质,分析蛋白的生物学意义和生物学功能,作为肺癌标志物的候选蛋白. 结果: 分别将8例肺癌组织及配对的癌旁组织可溶性总蛋白经过重复3次双向电泳,建立了肺癌组织蛋白质表达谱. 经PDQuest凝胶图像分析软件进行分析后, 12个蛋白质斑点只在肺癌组织有表达;6个蛋白质斑点只在癌旁表达. 对高丰度的肺癌特异表达的蛋白点进行鉴定,结果表明这些特异蛋白分别为钙粒蛋白B,Calgizzarin,载脂蛋白A-I,载脂蛋白E,Ras相关蛋白Rab-14,亲环素. 结论: 建立了人肺癌组织和癌旁组织的双向电泳图谱,为建立相应的蛋白质数据库提供了基础数据;鉴定了钙粒蛋白B等肺癌相关蛋白质,为进一步寻找肺癌蛋白标志物奠定了基础,对阐明肺癌发生的分子机制和预后研究有重要理论意义.     

胃癌组织差异蛋白表达谱的初步研究

目的:建立胃癌和癌旁胃黏膜组织pH 4~7蛋白质表达谱,分析胃癌和癌旁黏膜组织中蛋白质表达的差异。方法:提取胃癌及癌旁胃黏膜组织总蛋白,采用二维电泳获得胃癌和癌旁胃黏膜组织蛋白质表达谱并进行分析。结果:通过比较分析5对胃癌和癌旁胃黏膜组织pH 4~7蛋白质表达谱,共发现128个差异表达的蛋白质点,其中仅在胃癌组织中表达的蛋白质点56个,胃癌组织中失表达的蛋白质点27个,32个点在胃癌组织中表达上调,13个点在胃癌组织中表达下调。结论:胃癌与癌旁胃黏膜组织之间存在蛋白质表达差异。寻找胃癌与癌旁胃黏膜组织之间表达差异的蛋白质,为阐明胃癌发生的分子机制奠定基础。     

中分化肺腺癌及癌旁组织中差异蛋白质组学分析

目的分析人中分化肺腺癌及癌旁正常组织中的差异蛋白,寻找与肺腺癌发病相关的蛋白质。方法利用双向凝胶电泳法分离肺腺癌及癌旁正常组织中的蛋白质,通过图像扫描寻找差异2倍以上蛋白点,进而应用基质辅助激光电离飞行时间质谱得到肽质量指纹图谱,对比数据库确定差异蛋白。结果肺腺癌组织及癌旁正常组织平均蛋白点数分别为1 810±167、1 704±53。共筛选出18个差异蛋白点,其中13个差异蛋白点在肺腺癌组织中表达上升。结论双向凝胶电泳技术结合基质辅助激光电离飞行时间质谱可鉴定肺腺癌及癌旁正常组织的差异蛋白,为早期诊断肺癌、判断预后提供依据。     

运用激光捕获显微切割对肝细胞癌与肝内胆管癌蛋白质组的分析

目的:分析肝细胞癌和肝内胆管癌蛋白质的表达差异,获取鉴别两者的分子标志物.方法:通过激光捕获显微切割技术分离肝细胞癌和肝内胆管癌的纯细胞,通过双向电泳和质谱的方法检测两者表达的差异蛋白,再通过免疫组化染色的方法证实差异蛋白表达的情况.结果:肝细胞癌和肝内胆管癌图谱分别检测到(1 124±110)、(938±90)个蛋白点.分析发现78个差异蛋白点,通过质谱鉴定出28个有意义的蛋白,20个蛋白仅在肝细胞癌表达或表达明显增高,8个蛋白仅在肝内胆管癌中表达或者高表达.同时免疫组化证实BK125H2.1在肝细胞癌中表达强阳性,而肝内胆管癌中缺失表达.结论:激光捕获显微切割是蛋白质组研究中的一个突破性的技术,可以有效地解决组织异质性的问题;本实验检测到的差异蛋白例如BK125H2.1可能成为鉴别肝细胞癌与肝内胆管癌特异性的分子标记物.     

结直肠癌原发灶和肝转移灶组织中蛋白质组差异表达及临床意义

目的探讨结直肠癌发生和肝转移相关蛋白及其与肝转移的关系。方法采用等电聚焦／SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳法,对比分析结直肠癌原发灶、癌旁肠黏膜和肝转移灶中蛋白质组表达差异,经质谱分析、鉴定差异蛋白点;采用细胞转染方法,将差异蛋白基因导入到结直肠癌细胞,观察细胞生物学行为改变。结果结直肠癌原发灶、肝转移灶与正常肠黏膜蛋白质组分在PH7．0—9．5范围内有明显差别。分析13个差异蛋白点,其中2个蛋白点在癌原发灶组织中表达下调,5个蛋白点在原发灶组织中表达上调,6个蛋白点在肝转移组织中表达上调。经质谱鉴定,碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）在癌组织中表达下调,磷酸甘油酸激酶Ⅰ、延胡索酸水合酶、醛缩酶A在原发灶中表达上调。精氨酸酶,谷胱甘肽S-转移酶A3在肝转移灶中表达上调。将碳酸酐酶ⅡcDNA克隆转染HR-8348细胞后,癌细胞侵袭、趋化运动能力及耐药性均明显减弱。结论结直肠癌原发灶和肝转移灶蛋白质组表达有显著差异,碳酸酐酶Ⅱ表达下调和精氨酸酶、谷胱甘肽S-转移酶A3增强表达可使结直肠癌细胞生物学行为发生改变并促进肝转移发生。     

甲状腺癌蛋白质差异表达的观察

目的 由于甲状腺结节的高发率和鉴别良恶性的困难，所以需要寻找一种比较特异的分子标志。本研究的目的就是利用蛋白组学方法，建立人甲状腺癌和癌旁正常组织的双向凝胶蛋白图谱，寻找差异表达的蛋白质。方法 双向凝胶电泳分离人甲状腺癌及其周围正常组织的总蛋白质，通过图形软件分析比较，找出差异表达的蛋白质，利用质谱对差异表达的蛋白质进行鉴定。结果 建立双向凝胶图谱，平均蛋白质点数约为1000个左右。发现只在肿瘤表达的点有263个，表达上调2倍及以上的点有134个。在对差异点进行的质谱鉴定中发现了热休克蛋白27在肿瘤中表达下调。结论 建立了人甲状腺乳头状癌和癌旁正常组织的双向电泳图谱，并鉴定了一些与肿瘤相关的蛋白质。     

肺癌与良性胸腔积液蛋白质双向电泳图谱差异分析

目的:建立肺癌与肺良性胸腔积液的双向电泳图谱,分析二者表达蛋白质的差异及特点。方法:利用固相pH梯度双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离肺癌和肺良性胸腔积液中的总蛋白质。凝胶经银染色后用PDQUEST6.2.1电泳分析软件对胸水中的蛋白质谱进行分析,识别差异表达的蛋白质。结果:肺癌与肺良性胸腔积液的蛋白质组分布的基本框架很相似,并可发现二者之间有差异蛋白点;两种胸腔积液电泳图谱平均蛋白质点数分别为326±16和343±12,平均匹配点数为286±14和298±21,匹配率87.7%,86.9%.差异蛋白点82个,其中37个在肺癌胸腔积液中高表达,24个在肺癌胸腔积液中低表达。有17个点仅在良性胸腔积液表达,4个点仅在肺癌胸腔积液表达。结论:用双向电泳法得到了分辨率较高且重复率较好的肺癌与肺良性胸腔积液蛋白质组图谱,二者存在一些表达差异蛋白质。     

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞质蛋白双向电泳图谱的建立及初步分析

目的:建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(CaSKi细胞株)胞质蛋白双向电泳图谱,并初步分析找出特征性的差异蛋白点.方法:分别培养H8和CaSki细胞,用亚细胞结构蛋白质提取试剂盒提取胞质蛋白进行双向电泳,用ImageMaster 2D V2002.1图像分析软件分析电泳图谱,筛选差异蛋白点.结果:获得了分辨率和重复性均较好的宫颈永生化细胞和癌细胞胞质蛋白2-DE图谱,并分析找出了显著的差异蛋白点8个,其中3种蛋白质在宫颈癌细胞株表达上调,1种蛋白质表达明显下调,2种蛋白质在宫颈癌细胞株表达缺失,2种蛋白质在永生化细胞株表达缺失.结论:应用亚细胞蛋白双向凝胶电泳技术对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的胞质蛋白分析,能有效找出蛋白质表达差异点,为进一步确定宫颈癌前病变和癌细胞的关键性差异蛋白质的结构和功能奠定了基础.     

电离辐射对小鼠胸腺细胞蛋白质表达的影响

目的：观察低剂量Ｘ射线全身照射诱导小鼠胸腺细胞蛋白质表达变化及对细胞内外蛋白质交换的影响。方法：采用双向电泳方法。结果：７５ｍＧｙＸ射线全身照射小鼠后４ｈ,细胞浆出现４个新蛋白点、４个增强蛋白点及３个减弱蛋白点,正确细胞浆中的５个蛋白点在照射后消失。照射后细胞外液出现１个新蛋白点、１个增强蛋白点及１个减弱蛋白点。正常细胞上液中的３个蛋白 在照射后消失。正常细胞浆中的２个蛋白点在照射后分别减弱和消失     

大肠癌并肝转移的蛋白质组学研究

目的采用蛋白质组学技术研究有转移组和无转移组大肠癌组织蛋白质组表达的差异,分析和鉴定两组间特异表达的肿瘤蛋白质,探索大肠癌并肝转移发生的机制. 方法用等电聚焦/SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对比分析20例大肠癌患者原发灶、癌旁肠黏膜和肝转移灶中蛋白表达,经肽质量指纹谱分析、鉴定差异蛋白质.结果双向电泳图像对比分析表明,癌旁大肠黏膜组织、癌原发灶和肝转移灶中蛋白质表达有明显差异.在肝转移组中存在AnnexinA2蛋白和JE0350蛋白特异表达,磷酸丙酮酸水合酶和CAC15744蛋白表达上调;在无肝转移组存在CAD80231和A38983蛋白特异表达,AAH01166蛋白表达上调. 结论大肠癌并肝转移者与无肝转移者在蛋白质组表达上存在一定的差异.对这些差异蛋白质的进一步深入研究,可帮助了解大肠癌易发生远处转移的蛋白质组学机制及采取相应的处理对策.     

喉鳞形细胞癌比较蛋白质组的初步研究

目的:研究喉癌及癌旁喉正常黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳分离喉癌及癌旁喉正常黏膜组织总蛋白质,考马斯亮蓝染色显色、ImageMaster 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.取差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定.结果:获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,并找出在喉癌和癌旁喉正常黏膜组织差异表达的33种蛋白质.其中有22种蛋白质在喉癌组织中表达上凋,11种蛋白质表达明显下调.随机取10个在喉癌组织中表达上调的蛋白点进行质谱指纹图分析,查询数据库初步鉴定出了8个蛋白质.结论:本研究建立了分辨率和重复性较强的喉癌及喉正常黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,差异表达的蛋白质可能成为潜在的诊断喉癌的肿瘤标志物和治疗靶分子,对探讨喉癌的发生机制有重要意义.     

胃癌细胞SGC7901/ADR耐药相关蛋白质分子的差异展示

[目的]应用蛋白质组学技术寻找新的胃癌多药耐药相关蛋白分子,探讨胃癌多药耐药机制。[方法]以胃癌细胞SGC7901和阿霉素诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/ADR为研究对象,用固相pH梯度等点聚焦二维聚丙烯酰胺电泳技术展示两种细胞表达的全蛋白,凝胶考马斯亮蓝染色,Image Master 2D Melanie5.0凝胶分析软件分析并比较差异表达的蛋白分子。[结果]SGC7901中检测到414个蛋白点,SGC7901/ADR检测到553个蛋白点,两者匹配点386个,差异点71个,其中SGC7901/ADR蛋白质表达明显上调蛋白26个点,明显下调蛋白点45个。[结论]SGC7901/ADR细胞中差异蛋白分子可能与胃癌阿霉素耐药机制有关。     

酒精性肝损伤大鼠血清蛋白质组学的研究

通过对比分析酒精性肝损伤模型大鼠与正常对照组大鼠的血清蛋白质组表达谱,探讨参与酒精性肝损伤病理生理过程的分子机制。方法：采用双向电泳技术结合生物信息学分析方法对造模成功的酒精性肝损伤模型大鼠及正常对照组大鼠的血清全蛋白进行比较蛋白质组学分析。结果：获得了11个有明显规律性变化的差异表达蛋白点,其中有7个蛋白点表达升高,4个差异蛋白点表现为明显下调趋势。结论：本研究发现的这些差异表达蛋白质可能直接或间接参与了酒精性肝损伤病理生理过程的分子机制。     

肾癌及癌旁组织蛋白质组学的比较研究

目的：建立肾癌及癌旁组织比较蛋白质组学双向电泳技术研究体系。方法：取病理证实的肾癌及癌旁组织,研磨、超声裂解、抽提蛋白,采用双向凝胶电泳分离,进行染色,Image Master 2D Platinum软件分析、识别差异表达蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应肽质量指纹图谱,搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果：从双向电泳图谱上获得蛋白质斑点：肾癌组织(1326±78)个,癌旁组织(1232±56)个。显著差异蛋白质点46个,对其中7个点进行了筛选鉴定。结论：分析这些差异蛋白有助于寻找具有普遍性意义的肾癌标志物,进而为肾癌的早期诊断和防治提供理论和实验依据。     

CyclinE干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和蛋白质组的影响

目的:研究siRNA对HepG2细胞株cyclinE表达的抑制及细胞生长的影响,并用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质.方法:构建质粒表达载体pU6-cyclinE-shRNA,稳定转染肝癌HepG2细胞株,获得HepG2-cyclinEshRNA细胞系,RT-PCR检测cyclinE mRNA表达,MTT测定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期.裂解、抽提HepG2-cyclinEshRNA细胞和Cl期肝癌HepG2细胞全蛋白,用双向电泳技术进行分离后.用Proxpress2D分析软件对两组细胞全蛋白质表达谱进行差异分析,并应用MALDI-TOF-MS和数据库搜索鉴定差异显著的蛋白点.结果:HepG2-cyclinE-shRNA细胞与转染空质粒HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,生长速度减慢,出现G0/G1期细胞增多,C2/M和S期细胞减少.双向电泳后软件分析G1期肝癌HepG2细胞株平均检测到435±51(n=3)个蛋白点,HepG2-cyclinEshRNA细胞376±44(n=3)个,匹配分析,筛选出两组间差异6倍及以上且出现频率大于等于50%的蛋白点20个.应用质谱鉴定出角蛋白19、波形蛋白、神经多肽113等8个G1期HepG2细胞高表达蛋白点.结论:在HepG2细胞株中,导入eydinE干扰RNA,可有效抑制cyclinE的表达,进而使细胞增殖减缓,逆转其恶性表型.两组细胞蛋白质谱有明显差异,鉴定出G1期HepG2细胞高表达蛋白点8个,这些蛋白的高表达引起肿瘤的基因修饰异常、分化异常、增殖紊乱,肿瘤侵袭转移.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞双向电泳分析

目的 分析系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞蛋白质表达谱的变化.方法 分别抽取系统性红斑狼疮患者及健康对照者外周血,分离单个核细胞,抽提总蛋白,进行双向电泳,电泳胶银染显色,用ImageMasterTM 2D Platinum 5.0软件对获得的蛋白图谱加以分析,寻找差异表达的蛋白质.结果 对照组凝胶蛋白点匹配率为(71±4)%,SLE组匹配率为(72±4)%.对照组凝胶共检出蛋白点(791±17)个,SLE组检出(781±17)个.有11个蛋白点在SLE患者组表达上调,9个表达下调.结论 SLE患者外周血单个核细胞蛋白质表达发生了明显改变,为从淋巴细胞蛋白质谱变化的整体角度上阐明SLE发生的分子机制及免疫调控通路奠定了基础.     

针刺“太溪”穴对肾脏组织双向电泳图谱影响的实验研究

目的:利用双向电泳技术,观察针刺足少阴肾经原穴"太溪"穴前后肾脏组织双向电泳图谱的变化。方法:健康8周龄雄性Wistar大鼠18只,随机分为空白组、非经非穴组和针刺组,每组6只。非经非穴组每日针刺非穴点,针刺组每日电针双侧"太溪"穴,空白组大鼠在相同时间只予固定,不予针刺。1周后取出各组大鼠肾脏组织,提取肾脏组织总蛋白,进行双向电泳,比较分析各组肾脏组织双向电泳图谱的变化。结果:空白组和非经非穴组肾脏蛋白质未发现差异蛋白点;针刺组较空白组肾脏蛋白质显示9个3倍以上上调差异蛋白点,未发现下调蛋白质。结论:初步建立了大鼠肾脏组织蛋白质双向电泳的技术方法;针刺组大鼠蛋白质与空白组、非经非穴组存在明显差异,差异点的发现为下一步进行质谱分析奠定了基础。     

亚急性红斑狼疮皮损角质形成细胞的蛋白组学初步研究

目的建立亚急性红斑狼疮皮损和正常皮肤角质形成细胞双向电泳图谱,分析二者蛋白质的表达差异及特点。方法运用双向凝胶电泳分离6例亚急性皮肤红斑狼疮患者皮损和正常皮肤角质形成细胞总蛋白,考马斯亮蓝染色,比较分析差异蛋白表达。结果皮损和正常组电泳图谱平均蛋白质点分别为（1586±41）和（1601±49）,匹配率为78.69%和80.89%。差异蛋白质点共26个,16个在皮损高表达,2个在皮损组低表达,有6个点仅在病例组表达,2个点仅在正常对照组表达。结论获得分辨率高且重复性较好的双向电泳蛋白质组图谱,识别重复表达的差异蛋白。     

荷瘤大鼠60Co局部照射后骨髓蛋白质的差异表达

目的:观察荷瘤大鼠受60Co局部照射后骨髓中蛋白质的差异表达.方法:制备荷瘤大鼠动物模型,60Co局部照射后分别提取荷瘤组和照射组大鼠骨髓蛋白质,运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析2组荷瘤大鼠骨髓蛋白质的差异表达.结果:荷瘤大鼠经60Co局部照射骨髓有24个蛋白点表达发生变化,其中出现2个新蛋白点,4个蛋白点表达量下降,1个蛋白点表达量升高,17个蛋白点在照射后消失.结论:60Co局部照射可诱导荷瘤大鼠骨髓蛋白质差异表达.