幽门螺杆菌融合基因hspA-ureB重组质粒的构建及其编码蛋白抗原性预测

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)郑州分离株MEL-HP27的hspA-ureB融合基因的克隆,并运用生物信息学软件预洲融合蛋白HspA-UreB的空间结构和抗原性。方法：从重组质粒pNHA27和pNUB27分别纯化同收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序插入温控表达载体pBV220中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。利用生物信息学软件和Genbank数据库分析hspA-ureB表达蛋白的抗原性和空间结构。结果：质粒酶切电泳和特异PCR均可见2．06kb的融合基因片段。生物学软件分析显示：MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的长度为689个氨基酸,蛋白相对分子质量为76500,等电点为5．79,具有5个抗原活性结构域。结论：成功构建了MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的重组表达质粒,编码融合蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为H.pylori疫苗候选抗原。     

幽门螺杆菌omp11基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体的构建与表达

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)外膜蛋白基因(omp11)与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,为幽门螺杆菌疫苗和诊断抗原的筛选奠定基础。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA,用自行设计的PCR引物,从染色体DNA上扩增出omp11基因,将其克隆到表达载体pMAL-c2x中,用重组质粒转化大肠杆菌(E．coli TB1)。对重组质粒进行酶切鉴定,对目的基因片段进行测序。用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果：用PCR方法扩增的omp11基因长度为561bp;经酶切鉴定和测序,插入到载体的基因片段与文献报道相一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为28000,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的30％。结论：作者构建的pMAL-c2x与omp11基因重组质粒在E．coli TB1中能够高效表达目的基因,该重组质粒的构建为H．pylori omp11基因的研究建立了重要的基础。     

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的 构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435 bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达.结论 成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达.     

嗜肺军团菌flaA部分基因的克隆及其原核表达

目的克隆表达嗜肺军团菌的鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌I型DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建原核表达重组质粒pET-flaA。经PCR和限制性核酸内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳分析,用亲和层析法纯化其表达蛋白。结果扩增出嗜肺军团菌606bp的flaA部分基因,构建的重组质粒pET-flaA表达并纯化出42 kDa融合蛋白质。结论成功构建嗜肺军团菌flaA部分基因的原核表达载体,在原核系统中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌flaA部分基因的克隆及其原核表达

目的克隆表达嗜肺军团菌的鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌I型DNA为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET32a（＋）,构建原核表达重组质粒pET-flaA。经PCR和限制性核酸内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳分析,用亲和层析法纯化其表达蛋白。结果扩增出嗜肺军团菌606bp的flaA部分基因,构建的重组质粒pET-flaA表达并纯化出42 kDa融合蛋白质。结论成功构建嗜肺军团菌flaA部分基因的原核表达载体,在原核系统中得到了高效表达。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的温控表达及其免疫反应性检测

目的：在温控表达载体pBV220中实现幽门螺杆菌(H．pylori)融合蛋白HspA-UreB的表达,并研究其免疫反应性。方法：含重组表达质粒pBV-HU27的人肠杆菌DH5α经30℃增菌后,存42℃下诱导表达,SDS-PAGE分析融合蛋白表达含量,与H．pylori全菌免疫小鼠血清和H．pylori感染患者血清进行Western blot分析,检测融合蛋白的免疫反应性。结果：SDS-PAGE分析结果显示存76500处出现特异蛋白带,诱导4h即可达到最高量,融合蛋白HspA-UreB占全菌蛋白含量的10％,该融合蛋白可以被H．pylori免疫小鼠血清和H．pylori阳性患者血清中的相应抗体所识别。结论：H．pylori融合蛋白HspA-UreB可以在温控表达载体中正确表达,且具有良好的免疫反应性。     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据.方法:利用 PCR 技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性.结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp.经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%.结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础.     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

重组胸腺素α1 pMAL-C2x- Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1),采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

幽门螺杆菌外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因原核表达系统的构建与鉴定

目的:构建表达幽门螺杆菌(Hp)的外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因的重组蛋白质候选菌株,为Hp疫苗研究提供依据. 方法:用PCR方法扩增出带3个甘氨酸残基柔韧接头的融合基因omp22-hpaA, 将其克隆到表达载体pMAL-c2X中转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western Blot鉴定其免疫原性. 结果:测序结果显示, omp22-hpaA融合基因片段由1326 bp组成,为编码440个氨基酸残基的多肽,接头序列GGTGGAGGC已成功地插入omp22-hpaA融合基因中;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为53 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的20%. 结论:成功克隆并构建了omp22-hpaA融合基因原核表达系统.     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.