HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

小鼠LIF编码基因的克隆与真核表达载体pcDNA3.1-LIF的构建

目的：通过克隆小鼠LIF编码基因,构建pcDNA3.1-LIF真核表达载体,为下一步建立转基因动物模型奠定基础。方法：采用ICR雌性小鼠子宫组织,提取总RNA,运用RT-PCR技术,扩增出小鼠LIF基因全长编码序列,采用同源重组方法构建具有新霉素抗性的小鼠LIF真核表达载体pcDNA3.1-LIF。结果：通过PCR获得了约612 bp大小的特异性cDNA片段。经核苷酸序列分析,扩增得到的片段与小鼠LIF cDNA序列同源性为100%。经PCR及酶切鉴定筛选阳性克隆菌,表明LIF编码序列正确连入pcDNA3.1载体中。结论：成功克隆了小鼠LIF编码基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-LIF。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

14-3-3基因真核表达载体的构建

目的克隆人14-3-3基因并构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。方法从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人14-3-3基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带14-3-3基因的表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了14-3-3真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3,为进一步研究14-3-3在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

骨桥蛋白反义基因在食管癌浸润与转移中的作用

目的:探讨骨桥蛋白(OPN)反义基因对食管癌细胞增殖和转移的影响,为食管癌基因治疗提供理论依据。方法： PCR扩增获得人OPN基因,连接pcDNA3.1(+)载体,酶切、测序。脂质体介导将pcDNA3.1 -ANOPN基因转入ECA 109,G418筛选获得稳定表达ANOPN基因的转染细胞ECA-ANOPN、表达空载体的ECA-vect细胞及空白对照ECA 。RT-PCR检测ANOPN mRNA、免疫组织化学检测ANOPN基因蛋白表达。体外观察各组细胞生长速度、倍增时间,Transwell小室法检测细胞黏附、侵袭迁移能力的差异。结果：载体构建正确,测序结果与GenBank中公布的序列同源性为100%。与ECA-vect、ECA组比较,ECA-ANOPN细胞OPN的表达率明显降低（P<0.05）,生长速度明显减慢（P<0.05）,倍增时间增加（P<0.05）,透膜细胞数明显降低（P<0.01）。结论：ANOPN基因的稳定表达明显抑制ECA 109细胞的恶性表型。     

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（SLC7a8）基因cDNA的读码框（CDS）,构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（wistar-kyoto,WKY）肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1（＋）。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组（P〈0.05）及空质粒组（P〈0.05）。结论：成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆、测序和真核表达载体的构建

目的 克隆、测序人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架。方法 刀豆蛋白A活化的人外周血核细胞培养后用于提取总RNA,以随机引物行逆转录反应合成hIL-10 cDNA第一链,并以hIL-10 特异性引物行PCR扩增,将PCR产物克隆至pUC18中测序并构建真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结果 PCR扩出550bp特异性片段,经克隆至pUC18后测序表明序列同源性与GenBank报道完全一致,并克隆鉴定了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结论 成功克隆了人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架,序列分析证实与ＧenBank录入序列同源性达１００％,并成功构建了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。     

MCP-1真核表达载体的构建和鉴定

目的构建大鼠MCP-1真核表达载体pcDNA3.1（＋）-MCP-1。方法据Genebank中大鼠MCP-1cDNA序列设计并合成特异性引物,提取糖尿病模型大鼠肾脏总RNA,利用PCR技术扩增出MCP-1全编码区基因片段,并将扩增产物TA克隆至pMD-18T载体,然后分别双酶切pMD-18T-MCP-1回收目的片段再克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中。结果PCR扩增得到大鼠成熟MCP-1的cDNA片段大小为500 bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（＋）-MCP-1。结论成功构建了大鼠MCP-1真核表达载体,为进一步研究MCP-1的DNA疫苗奠定基础提供了条件。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。