西洋参赤霉素20-氧化酶基因的克隆与序列分析

目的对西洋参Panax quinquefolium种子休眠与萌发过程中赤霉素20-氧化酶(GA20ox)基因编码区进行克隆及生物信息学分析。方法根据西洋参种子转录组的注释信息,得到9条GA20ox相关序列,通过比对分析确定了GA20ox的转录本。采用q RT-PCR方法得到西洋参GA20ox(Pq GA20ox)的c DNA全长,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法检测Pq GA20ox基因在根、茎、叶和种子休眠不同时期的表达水平。结果生物信息学分析表明,Pq GA20ox基因全长1 092 bp,编码363个氨基酸残基,Pq GA20ox编码蛋白不含跨膜区,不含信号肽。q RT-PCR实验结果显示Pq GA20ox基因在形态休眠起始期和生理休眠起始期表达量高于其他时期。结论首次获得Pq GA20ox基因的编码区序列,为进一步研究西洋参种子解除休眠的分子机制奠定基础。     

铁皮石斛HDS基因的克隆与初步表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase,HDS)基因,在大肠杆菌中诱导融合蛋白,并探究该基因在铁皮石斛不同组织中的表达规律。方法采用RT-PCR和RACE等方法获取铁皮石斛HDS(Do HDS)的c DNA全长,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,使用Real-Time PCR分析Do HDS在不同组织的表达特征,构建原核表达载体p ET-28a(+)-Do HDS,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果成功获得Do HDS的c DNA全长序列,Gen Bank登录号为KJ161312,全长2 666 bp,ORF为2 238 bp,编码745个氨基酸。Do HDS在各组织中均有表达,在茎中表达量最高,为原球茎的5倍;SDS-PAGE结果显示诱导产物为1个相对分子质量(82 700)与理论值相符的融合蛋白。结论克隆了Do HDS的c DNA全长序列,探究其在不同组织中的表达模式,建立了原核表达体系,为后续研究Do HDS的功能提供了一定的理论基础。     

铁皮石斛WRKY5基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Do WRKY5基因,并对生物信息学和表达模式进行分析。方法通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从铁皮石斛中克隆到一个WRKY基因,利用生物信息学工具对其进行分析,并利用荧光定量PCR分析其在铁皮石斛中的组织表达模式及在低温胁迫、脱落酸(ABA)胁迫和蔗糖渗透胁迫下的表达模式。结果获得长1 336 bp的Do WRKY5基因转录因子c DNA全长序列,开放阅读框为834 bp,编码277个氨基酸残基,含有一个WRKY基因保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第II类成员。q RT-PCR分析表明,Do WRKY5基因在铁皮石斛根、茎、叶中均有表达,但在叶中的表达量最高。在不同低温和4℃不同时间诱导处理后,该基因表达量均显著升高,并且该基因在ABA胁迫和蔗糖渗透胁迫下均可被诱导表达。结论 Do WRKY5基因在铁皮石斛应答低温胁迫等多种非生物胁迫中可能起重要的调控作用,为进一步研究铁皮石斛的抗寒机制和抗寒性品种的选育提供基础。     

铁皮石斛1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因的克隆与表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphatereductase,HDR]基因,并分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及不同信号分子诱导下的表达模式。方法采用RT-PCR和RACE等方法获得铁皮石斛HDR基因(Do HDR)全长,利用DNAMAN和MEGA6.0对其他物种的HDR基因编码的氨基酸序列进行同源性分析和进化关系分析,使用实时荧光定量分析HDR基因的表达模式。结果成功获得Do HDR基因,Gen Bank登录号为KC344827,全长1 658 bp,编码460个氨基酸,与其他科属植物的同源性达到80%以上。Do HDR基因在铁皮石斛叶片中表达量最高,从高到低依次是根、茎、原球茎;且受到脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)信号分子的诱导。结论从铁皮石斛中获得Do HDR基因,为进一步阐明铁皮石斛萜类化合物合成途径中该基因的重要作用奠定了理论基础。     

铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A的克隆与表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用铁皮石斛F-box蛋白基因即S期激酶相关蛋白(S phase kinase-associated protein)基因DoSKP2A,并进行生物信息学和表达特征分析。方法采用RACE技术获基因全长;利用生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建;借助定量PCR检测基因表达模式。结果克隆到DoSKP2A(GenBank注册号KU160472),c DNA全长1 507 bp,开放阅读框(ORF)长1 101 bp,编码蛋白含366个氨基酸,相对分子质量39 590,等电点7.9。DoSKP2A蛋白不含跨膜域和信号肽,包含F-box核心结构域(26～88)、亮氨酸重复序列LRR(202～226)和多个保守基序;Do SKP2A与植物SKP2As蛋白一致性为64.6%～72.4%,所在分支隶属于SKP2As分子进化的单子叶植物分支,与小兰屿蝴蝶兰SKP2A亲缘关系近;DoSKP2A基因转录本在石斛3种器官中为组成型表达,根中相对表达量较高,为叶中的6.16倍,茎中次之,叶中表达量很低。结论获得一个全新的铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A全长、生物信息及其表达特征,为研究其在铁皮石斛生长发育、信号传导和抗逆境胁迫的分子机制提供基础。     

铁皮石斛DoSRK2E基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛蔗糖非酵解1型相关蛋白激酶2(Sn RK2)家族基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过RT-PCR、RACE克隆铁皮石斛Sn RK2(DoSRK2E)基因c DNA全长,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、结构域、跨膜结构、信号肽及亚细胞定位等;利用DNASTAR和MEGA进行多序列比对和系统发育关系重建分析;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测基因组织表达模式。结果获得铁皮石斛DoSRK2E基因(GenBank登录号API65110),cDNA全长1 795 bp,包含1个1 086 bp的完整开放阅读框,编码蛋白相对分子质量40 850,等电点4.80,无信号肽和跨膜域,包含1个蛋白激酶结构域、1个ATP结合位点和1个Ser/Thr蛋白激酶活化位点,预测定位在内质网膜上;DoSRK2E蛋白与植物SnRK2蛋白序列高度一致,系统发育位置位于SnRK2亚家族的分支III,与拟南芥At SnRK2.6的亲缘关系最近;DoSRK2E基因在铁皮石斛根中表达量最高,茎中次之,叶中最低。结论首次从珍稀濒危药用植物铁皮石斛中克隆得到SnRK2家族基因DoSRK2E,对其分子特性与组织表达模式进行了分析研究,为进一步揭示该基因在铁皮石斛逆境胁迫中的作用机制提供基础。     

铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)基因,并对其在F型和H型铁皮石斛中的表达进行分析,为研究铁皮石斛pepc基因的结构、功能提供依据。方法基于GenBank上已知的pepc基因的同源序列设计引物,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛pepc基因全长。采用荧光定量PCR方法研究pepc基因在2种铁皮石斛中的表达。结果成功克隆了铁皮石斛pepc基因,登录号为JF423930,该基因全长为3 560 bp,其中cds序列为2 895 bp,与兰科植物的同源性为80%左右,与其他科属植物的同源性达到70%以上,编码964个氨基酸。pepc基因在F型铁皮石斛中的表达量为H型的5.55倍。结论成功克隆了铁皮石斛pepc基因,且F型铁皮石斛pepc基因的表达量高于H型。     

铁皮石斛DoMAPK5基因的克隆及表达特征分析

目的克隆及分析铁皮石斛DoMAPK5基因的表达特征。方法利用cDNA末端快速克隆技术(RACE),首次从铁皮石斛接菌共生萌发种子中分离得到1个新的MAPK基因,对其编码蛋白的理化性质、保守结构域等特征及进行了分析。并应用荧光定量PCR对DoMAPK5基因在石斛不同组织中表达模式分析。结果 DoMAPK5基因(Gen Bank注册号KJ472788),全长为2184bp、编码一条597个氨基酸的肽链,预测分子量为67.39KDa,等电点为9.28,编码的蛋白均不含信号肽,在210-232位具有23个氨基酸的跨膜域,具有MAPK蛋白家族保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域及MAPK位点。序列比对及系统发育树分析结果表明DoMAPK5基因与葡萄MAPK基因均具有很高的相似性(82%),与水稻MAPK10亲缘关系最近。应用荧光定量PCR对DoMAPK5基因在石斛不同组织中表达模式分析显示,该基因在未接菌的植物组织中属组成型表达,在接菌共生萌发的植物组织中显著上调,为未萌发种子的10.49倍。结论 DoMAPK5在植物组织中属于组成型表达,具有受菌根真菌诱导表达的特征。     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制差减杂交文库的构建及序列分析

 目的 研究铁皮石斛（Dendrobium officinale）种子接菌共生萌发差异基因表达谱特征。方法 采用抑制差减杂交（SSH）技术,分别以接菌及未接菌培养5周的铁皮石斛种子cDNA作为检测子与驱赶子,构建铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制性消减cDNA文库。结果 对部分克隆产物测序,经GenBank中BLASTx同源比较后,进行基因功能注释,得到100个具有植物同源性的表达序列标签（EST）,主要涉及细胞与染色体结构、RNA合成、信号转导、能量与代谢、蛋白质合成与降解及细胞防御等。随机挑选5个目标基因,实时荧光定量PCR分析发现这5个基因在共生萌发的种子中均上调表达。结论 铁皮石斛种子接菌共生萌发涉及多种途径相关基因表达调控,本实验为兰科植物种子萌发分子机制研究奠定基础。     

赤霉素对NaCl胁迫下大黄种子萌发和幼苗生长的影响

目的 研究NaCl胁迫下掌叶大黄Rheum palmatum、唐古特大黄R.tanguticum和药用大黄R.officinale种子萌发及幼苗生长特性及赤霉素（GA3）引发对盐胁迫下种子萌发及幼苗发育的影响。方法 设置0、100、150、200、250 mmol/L NaCl胁迫，200、250 mg/L GA3拌种或浸种实验，双层滤纸培养法分析盐胁迫下3种大黄种子萌发及幼苗生长指标。结果 3种大黄种子发芽率随NaCl浓度增加直线下降、盐相对伤害率直线上升（P＜0.05），子叶长、胚轴长、根长和苗长等受到强烈抑制（P＜0.05）。200 mmol/L NaCl下GA3拌种或浸种能显著提高掌叶大黄种子发芽率（P＜0.05），250 mmol/LNaCl下仅GA3拌种有作用（P＜0.05）；200 mmol/L NaCl下2个质量浓度GA3拌种、低质量浓度浸种提高唐古特大黄种子发芽率（P＜0.05），250 mmol/L NaCl下GA3无促进作用（P＞0.05）；GA3拌种和高质量浓度GA3浸种能提高150 mmol/L NaCl下药用大黄种子发芽率（P＜0.05），100 mmol/L NaCl下GA3无促进作用（P＞0.05）。GA3浸种能促进盐胁迫下掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄幼苗根和苗的生长（P＜0.05）。结论 NaCl胁迫下3种大黄种子萌发及幼苗生长均受到抑制，3种大黄种子和幼苗耐盐性有差异，药用大黄耐盐性最低，GA3拌种或浸种引发能不同程度缓解高盐胁迫下大黄种子萌发和幼苗发育。     

西洋参PqGA2ox基因的克隆与序列分析

目的 克隆、分析西洋参Panax quinquefolium种子萌发过程的赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidase,GA2ox)基因.方法 从前期由高通量测序得到78 207条unigenes基因的注释信息中挖掘出与赤霉素合成和分解代谢相关的基因序列,得到11条GA2ox基因相关序列,通过序列比对分析确定GA2ox的转录本.根据选定的unigene序列设计引物,采用PCR方法扩增西洋参GA2ox的cDNA全长;利用生物信息学方法分析所得基因,并用实时荧光定量PCR技术进行表达分析.结果 得到一条长度为987 bp,编码328个氨基酸残基的西洋参GA2ox基因,命名为PqGA2ox.生物信息学预测PqGA2ox蛋白不含跨膜区,不含信号肽,具有依赖于2-酮戊二酸和Fe²⁺的双加氧酶超家族的保守结构域.实时荧光定量PCR结果显示在形态休眠中期和生理休眠中期的表达量低于其休眠起始期和解除休眠期.结论 首次获得西洋参种子PqGA2ox基因的编码区序列,为进一步研究西洋参种子解除休眠的分子机制奠定基础.     

蚬壳花椒ZdICL基因的克隆表达以及种子萌发过程中表达量变化

目的克隆表达蚬壳花椒种子萌发过程中油脂代谢关键调控基因,研究该基因在蚬壳花椒种子外源激素赤霉素(GA)促萌发下调控蚬壳花椒种子人工萌发分子机制。方法根据蚬壳花椒转录组测序结果,筛选克隆油脂代谢关键基因,并利用原核表达体系表达纯化目的蛋白,对其编码产物进行生物信息学分析和预测。种子萌发实验分为清水对照组与GA促萌发实验组,设定0、6、12、24、48 h为萌发取样点,相对荧光定量分析该基因表达量变化。结果通过克隆该基因片段及序列分析,确定该基因编码异柠檬酸裂解酶(ICL),将其命名为ZdICL。该基因开放阅读框全长为1 728 bp,编码产物包含575个氨基酸。构建原核表达载体pET-28a-ZdICL,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,对该基因编码产物的氨基酸序列进行聚类分析表明,其与甜橙同源性最高,而与模式生物拟南芥同源性最低。在种子萌发过程中其表达量在GA促萌发过程中第48小时前逐步降低,到第48小时表达量升高,与外源激素GA对种子萌发过程中脂肪动员代谢调控相吻合。结论通过对ZdICL基因进行克隆表达以及表达量分析,初步认为蚬壳花椒种子自然繁育率低下的原因之一可能是自身内源激素GA含量不足,导致ICL活性不足,无法有效保护种子抵御氧化损伤,致死种现象较多,同时为探索该基因在蚬壳花椒种子萌发过程中的调控功能奠定基础。     

四川野生铁皮石斛株丛时空格局的动态演化

目的 阐释自然环境下野生铁皮石斛株丛时空格局及生活史特征,为铁皮石斛原地保护、回归保育和仿野生栽培提供参考。方法 以四川省石棉县收集的114丛野生株丛为研究材料,比较不同等级株丛生长情况差异,并对可明确辨别丛龄的74个实生小株丛合轴生长及花序柄（或花序柄痕）残留情况进行观察,探讨野生铁皮石斛株丛时空格局及生活史特征。结果 野生铁皮石斛假鳞茎茎节数、茎长、株丛根数、根长和根粗随假鳞茎数量增加而增加,但茎粗无明显变化规律;实生小株丛的第一年茎（种子萌发茎）和第二年茎（分蘖茎）生长缓慢、短小,完成由种子到种子的生活史周期约需4年或更长;高位腋芽较少,高芽繁殖并非该野生铁皮石斛居群的主要繁殖方式,其通过合轴生长的分蘖繁殖扩大株丛并实施有性繁殖,株丛生长到一定阶段开始衰退。结论 四川省石棉县有野生铁皮石斛分布。株丛调查表明,野生铁皮石斛主要通过种子萌发的实生苗及分蘖繁殖实现种群更新。建议利用铁皮石斛果实里种子数量大的优势积极开展原生境播种和回归保育,对川产石斛资源发掘（含文化挖掘）、保护及可持续利用进行了探讨。     

药用真菌猪苓菌核无机磷酸盐转运蛋白基因的分子克隆与特性分析

目的克隆猪苓Polyporus umbellatus菌核无机磷酸盐转运蛋白基因并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR技术从猪苓菌核中克隆得到1个无机磷酸盐转运蛋白(inorganic phosphate transporter)基因,利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域、信号肽和跨膜结构等分子特性;采用Clustal W2以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式。结果猪苓无机磷酸盐转运蛋白基因命名为Pu Pi T(NCBI登录号:KU179154)。该基因开放读码框全长为1 590 bp,编码530个氨基酸。Pu Pi T蛋白相对分子质量为57 552,等电点6.82。氨基酸序列分析表明,Pu Pi T蛋白具有12个跨膜区。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示Pu Pi T与Moniliophthora rorer亲缘关系最近,与Moniliophthora roreri、双色蜡蘑Laccaria bicolor、Heterobasidion irregulare有较高的同源性,荧光定量PCR结果表明,Pu Pi T在与蜜环菌共生的猪苓菌核及未与蜜环菌共生的菌核中都有表达,其中共生部分的表达量显著上调,约是未共生部位的12倍,说明其参与猪苓与蜜环菌共生过程。结论 Pu Pi T基因克隆和分子特征为进一步研究揭示其在猪苓菌核磷元素转运及与蜜环菌共生过程中的调控作用奠定基础。     

七叶一枝花种子萌发不同阶段生理生化变化研究

目的探讨七叶一枝花Paris polyphylla var.chinensis种子萌发不同阶段的酶和内源激素调控机制,为其种子解除休眠、萌发不同阶段采取有效处理措施,提高出苗率提供科学依据。方法通过观察和测定变温层积处理后七叶一枝花种子萌发不同阶段形态差异,采用常规的生理生化方法测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苹果酸脱氧酶(MDH)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)5种酶活性,采用质谱定量方法测定吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、反玉米素(TZ)、茉莉酸(JA)量;研究种子萌发过程中胚率与酶活性和内源激素量变化之间的相关性。结果七叶一枝花种子从未萌动、上胚轴休眠到即将出苗阶段,种子质量和胚率逐步上升;SOD和POD活性逐步升高;CAT和MDH活性逐步减弱,G-6-PDH活性出现双峰,未萌动阶段和萌动后上胚轴未伸长阶段显著高于其他阶段;IAA、GA3、ABA、JA的量逐步升高,IAA和JA量在即将出苗阶段显著高于其他阶段(P0.01);TZ和SA的量先升高后降低,TZ的量在子叶分化形成期和胚乳成熟期显著高于其他阶段(P0.01),SA出苗前期量最高,已萌动胚根刚突破种皮阶段和胚乳形成阶段量次之;CAT酶活性变化与胚率呈显著负相关,IAA和JA的量变化与胚率呈显著正相关。结论CAT对种胚的生长有抑制作用,IAA与JA对种胚的生长有正向促进作用。     

穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因的克隆与表达

目的从穿心莲中克隆穿心莲内酯合成途径中的香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)基因,并进行组织表达等特征研究。方法采用CTAB-LiC1法从穿心莲茎和叶中提取总RNA,简并引物扩增获得保守区段,RACE法获得基因全长,ProtParam等软件分析基因特征,实时荧光PCR法检测不同发育时期穿心莲茎和叶中基因的表达。结果获得了一个长1 047 bp的GGPS基因,编码一条由348个氨基酸组成的蛋白质序列,与长春花的GGPS蛋白亲缘关系较近,N端含有一个由47个氨基酸构成的质体信号肽。在穿心莲的茎和叶中,GGPS基因在花蕾期表达量较高,初花期降低;到了花果混合期表达量升高,青果期下降。表明穿心莲花蕾期和花果混合期相关代谢成分的合成可能更活跃。结论从穿心莲中克隆了GGPS基因,为开展穿心莲内酯合成途径的调控奠定了基础。