基于Illumina Miseq分析黄精根腐病根际土壤真菌群落结构及多样性＊

目的研究患根腐病和健康黄精的根际土壤真菌群落结构组成、丰富度和多样性变化情况,为查明黄精根腐病发生机制提供线索。方法以4年生黄精根腐病根际土壤(GG组)、4年生健康黄精根际土壤(GJ组)和未种过黄精的土壤(GK组)为研究对象,采用Illumina Miseq技术分析土壤真菌群落结构组成。结果 9个土壤样品基因组共获得有效ITS1序列1063335条,病株组土样真菌OTUs数显著少于健康组和空白组土样。种群多样性指数显示病株组最低,空白组最高,在门分类水平上,患根腐病组及健康组土样的主要优势菌群均为子囊菌门、担子菌门、Zoopagomycota、毛霉门、壶菌门。在属分类水平上,3组真菌群落结构组成及丰度差别较大,与黄精根腐病相关的病原菌镰刀菌属Fusarium存在于所有样品中,而有益菌木霉菌属在健康组和空白组土样的丰度显著高于患病组土样。结论黄精根腐病株和健康株根际土壤微生物组成具有显著性差异,对于探究黄精根腐病发生的微生态机制和改良种植黄精土壤微生物具有理论指导作用。     

石柱黄连根腐病根际土壤细菌微生态研究

该研究应用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台,分析了未种植黄连土壤、黄连健株及病株根际土壤的细菌种群丰富度及多样性变化,并结合土壤养分及酶活变化检测,对黄连根腐病产生的机制进行了深入探讨。高通量测序显示,栽培黄连造成了土壤细菌种群的丰富度的显著降低(P0.05)和细菌种群多样性的降低;罹患根腐病的黄连植株根际土壤细菌的种群丰富度要显著低于未种植和健康黄连土(P0.05),种群多样性要显著低于未种植黄连土样(P0.05),但与健株土样之间差异不显著。对土壤的养分及酶活测定结果表明,栽培黄连造成了土壤pH、有效磷、脲酶活性的显著降低,蔗糖酶活性的显著升高(P0.05);根腐病土样中有机碳的含量、碱解氮、过氧化氢酶和脲酶活性显著低于健康土样,速效磷和速效钾含量显著高于健康土样(P0.05)。综合分析表明,栽培黄连造成了土壤中细菌种群丰富度和多样性的降低;病株土样中,细菌种群丰富度的显著降低和种群多样性的降低,有可能是导致黄连根腐病产生的一个重要原因,此外,土壤有机碳和过氧化氢酶活性的显著减低,也许是导致黄连根腐病发生的一个诱因。     

不同种植年限黄连根系土壤细菌PCR-DGGE分析

该研究应用PCR-DGGE技术,分析了不同种植年限正常生长、发病的黄连Coptis chinensis的根际和非根际土壤的细菌种群多样性指数,并选取代表性DGGE条带进行克隆测序,构建细菌系统发育树状图。结果表明,正常土样与发病土样土壤细菌种群差异明显,且发病土样多样性指数(H)高于正常土样;代表性条带克隆测序结果表明,黄连种植土壤中未培养细菌为优势菌群,其余类群为食酸菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、未培养克吕沃尔菌属以及未培养丛毛单胞菌,未发现已报道的植物病原细菌。发病土样中Clone band d的谱带亮度高于正常土样,该条带菌株在分类上属于食酸菌属。显然,黄连种植过程中,根际土壤中细菌种群发生了改变,其中食酸菌属的细菌在发病根际土壤增加,很可能与黄连病害发生有关。     

黄连根腐病镰刀菌属病原真菌鉴定

根腐病是黄连的主要病害之一,近几年大面积爆发,给生产造成了严重损失,也大大打击了连农的积极性。为了明确其病原真菌,采用组织分离法分离出病根镰刀菌属真菌,通过离体回接初步筛选出疑似病原真菌,再进行活体回接明确病原菌,结合分子鉴定和形态鉴定将病原菌鉴定到种。结果共计分离到镰刀菌属真菌20株,其中的5株离体回接和活体回接均显示强致病性。根据以上结果推断,尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌F.solani、三线镰刀菌F.tricinctum是黄连根腐病的病原真菌,且可能是复合侵染的前期入侵菌,其中尖孢镰刀菌在分离出的镰刀菌中占据优势,其他镰刀菌分离频率相对较低,因此在大田生产中应针对该菌进行重点防护。高温和高湿度会增强镰刀菌的致病性,据此推测,全球气候变暖使原本冷凉的黄连产区气温升高,适合病原菌生长繁殖入侵,可能是导致近年黄连根腐病大爆发的主要原因之一。因此,解决黄连根腐病的方法除了研发和施用农药,还可以将种植基地向高海拔地区转移。     

不同产量下天麻根际土壤微生物多样性分析

目的 分析不同产量下天麻根际微生物的多样性,探讨土壤微生物对天麻产量的影响。方法 该试验采用16S DNA和内转录间隔区（ITS）序列高通量测序对天麻根际土壤中高产土样（GC）和低产土样（DC）下的细菌和真菌群落多样性进行分析。结果 天麻根际土壤中细菌占主导地位的有变形杆菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes和其他不明细菌unidentified Bacteria,真菌占主导的为子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、被孢霉门Mortierellomycota;高产和低产天麻根际土壤中微生物群落丰度没有差异,仅在群落组成上存在显著差异,高产天麻根际土壤中慢生根瘤菌Bradyrhizobium、施氏乳酸杆菌属Schleiferilactobacillus、古根菌属Archaeorhizomyces等38属微生物大量聚集,低产天麻根际土壤中则镰刀菌属Fusarium、鬼伞属Coprinellus、氨氧化古菌属Nitrosotalea等30属微生物大量聚集;在属和种的水平上,发现6个差异物种,绒紫红菇Russula mariae、古根菌属Archeaeorhizomyces、土赤壳属Ilyonectria偏向集中于高产天麻根际土壤中,氨氧化古菌属Nitrosotalea、簇生鬼伞Coprinellus disserminatus、镰刀菌属Fusarium则偏向集中于低产天麻根际土壤中。结论 在不同产量下,天麻根际土壤中的真菌群落和细菌群落中均存在差异微生物,推测这些微生物与天麻产量高低有关,研究结果可为后续天麻的高产研究提供重要的理论基础。     

天麻-冬荪轮种模式对土壤微生物群落结构的影响

天麻-冬荪轮种模式是贵州产区采用的一种新型种植模式,但是天麻-冬荪的种植对土壤微生物群落结构的影响尚不清楚。因此,该研究采集未种植天麻土壤为对照(CK),分别采集天麻块茎际土壤(GE)、蜜环菌菌索区际土壤(AGE)、天麻-冬荪轮作后的白鬼笔Phallus impudicus菌丝区际土壤(PI),采用ITS和16S rDNA高通量测序技术对土壤真菌和细菌的群落组成进行测定分析。结果表明,通过OTU聚类和主成分(PCA)分析发现,AGE和GE土壤微生物聚为一类,PI和CK土壤微生物聚为一类;与CK相比,AGE和GE土壤微生物的多样性和丰度均显著增加;而与AGE和GE相比,PI土壤微生物的多样性和丰度均降低。物种注释表明,与CK相比,AGE和GE土壤中担子菌门Basidiomycota、酸杆菌门Acidobacteria、绿弯菌门Chloroflexi的丰度明显减少,而子囊菌门Ascomycota、接合菌门Zygomycota、变形菌门Proteobacteria丰度明显增加;与AGE和GE相比,PI则与之相反,PI与CK土壤微生物丰富度较为相似。此外,蜜环菌与冬荪菌共培养表明冬荪菌可以明显抑制蜜环菌的生长。由此推测,冬荪菌对土壤微生物群落结构的影响表现为通过抑制蜜环菌的生长,从而使土壤微生物群落结构得以恢复。     

基于高通量测序和化学轮廓分析研究黄连在连栀矾溶液发酵炮制中的作用

目的探究黄连Coptidis Rhizoma在连栀矾溶液传统发酵炮制中的作用。方法按照连栀矾溶液传统配方比例,将其拆分为3组配方溶液:连栀矾组(黄连+栀子+白矾)、黄连组(黄连+白矾)和栀子组(栀子+白矾),采用HPLC分析比较3组溶液发酵前后的化学成分变化轮廓,采用Illumina Hiseq高通量测序技术测定并比较发酵溶液中微生物的群落特征。结果传统配方连栀矾经发酵后环烯醚萜类成分发生了较显著的变化(P<0.05),生物碱类成分未发生明显变化,拆分后的黄连组中生物碱类成分和栀子组中环烯醚萜类成分均没有发生明显变化。分别对各组发酵溶液进行测序,根据α多样性分析结果,3组发酵液中真菌多样性为连栀矾组<栀子组<黄连组,真菌的丰富度为栀子组<连栀矾组<黄连组;细菌多样性为连栀矾组<黄连组<栀子组,细菌的丰富度为连栀矾组<栀子组<黄连组。根据β多样性分析结果,3组溶液中的真菌和细菌的群落结构均有明显差异。根据微生物相对丰度分析可知,3组的优势真菌均为子囊菌门、担子菌门和罗兹菌门,不同组间丰度无明显差异;真菌优势属中的孢霉属的丰度在连栀矾组最高,显著高于另外2组(P<0.05),栀子组又显著高于黄连组(P<0.05);韦斯特壳属的丰度在连栀矾组中最低,显著低于黄连组和栀子组(P<0.05),后两者间丰度无明显差异。3组的优势细菌均为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中连栀矾组中变形菌门的丰度极显著低于黄连组和栀子组(P<0.01),厚壁菌门的丰度在连栀矾组中极显著高于黄连组和栀子组(P<0.01),放线菌门和拟杆菌门的丰度在3组发酵溶液的差异较小;细菌优势菌属中的乳杆菌属在连栀矾组中显著高于黄连组和栀子组(P<0.05),在黄连组中也显著高于栀子组(P<0.05),伯克氏菌属丰度在黄连组和栀子组中无显著差异,都显著高于连栀矾组中的丰度(P<0.05)。结论连栀矾溶液配方中的黄连能提高其中栀子的有效成分的发酵转化,并且是通过对发酵体系中的优势菌属的丰度进行调节而发挥作用的。进一步佐证了传统配方制剂的合理性和科学性。     

外源添加镰刀菌和木霉菌对农田栽参土壤真菌群落的影响

目的 探究外源添加镰刀菌和木霉菌对农田栽参土壤真菌群落多样性和碳代谢功能多样性的影响。方法 通过Illumina HiSeq 2500高通量测序和Biolog-ECO联用技术，分析不同处理农田栽参土壤真菌群落物种多样性和功能多样性。结果 高通量测序结果显示，添加外源微生物后，农田栽参土壤的微生物数量和种类显著改变，相对丰度>1%土壤真菌类型分别为被孢霉属（Mortierella sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）、腐质霉属（Humicola sp.）和拟青霉属（Simplicillium sp.）真菌，其中各处理组被孢霉属均显著升高；外源添加镰刀菌可引起腐质霉属和拟青霉属等真菌增加，添加高浓度木霉菌能显著抑制镰刀菌的生长；由Biolog和主成分分析可知，外源添加高浓度木霉菌组的平均颜色变化率（AWCD）显著高于对照组和镰刀菌低浓度组，且对氨基酸、羧酸、多聚物及胺类的利用能力增强，而外源添加高浓度镰刀菌组（LG）土壤微生物代谢活性降低，且两者土壤微生物对酚酸类碳源的利用程度均无显著提高。结论 外源添加镰刀菌协同引起其他致病真菌的生长繁殖，外源添加木霉菌有利于增强农田栽参土壤真菌群落结构和代谢多样性，抑制镰刀菌增殖，改善农田栽参土壤微生物环境。     

西洋参根腐病发生与根际土壤细菌群落结构变化关系研究

目的研究健康西洋参和患根腐病西洋参的根际土壤细菌群落结构变化,为查明西洋参根腐病发生机制提供线索。方法以未种过西洋参的土壤(C组)、4年生健康参根际土壤(N组)和4年生根腐病参根际土壤(R组)为研究对象,采用Illumina Miseq高通量测序技术分析了土壤细菌群落结构的变化。结果 9个土壤样品基因组经16 S测序共获得有效序列636 654条,用于物种分类的OTUs 8 422个,涵盖了42门、106纲、180目、158科、246属。在门的水平上,3组细菌主要类群基本一致,主要有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)等,但不同组中各类群相对丰度存在明显差异;在属的水平上,3组细菌群落组成及相对丰度差别很大,其中红游动菌属Rhodoplanes、Kaistobacter属、鞘脂菌属Sphingobium等可能是引起西洋参根腐病发生的关键菌群,后续研究应重点关注。结论西洋参根腐病株和健株根际土壤微生物组成具有显著性差异,对于探究西洋参根腐病发生的微生态机制和改良种植西洋参土壤微生物具有理论指导作用。     

基于高通量测序分析连栀矾溶液发酵炮制过程中真菌菌群多样性变化

目的探究传统连栀矾溶液发酵炮制过程中真菌菌群多样性和优势菌群,为科学发酵提供理论依据。方法采用Illumina HiSeq高通量测序技术测定不同发酵时间上下层连栀矾溶液中真菌ITS2区序列,应用QIIME、Mothur和R等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTU)数量,分析样品中真菌菌群的组成、丰度、分布、alpha多样性、beta多样性,阐明炮制过程中真菌菌群结构、多样性及丰富度的动态变化。结果 4个不同的发酵时期共获得用于分析的有效序列数为207 068,稀疏曲线表明测序深度充分,OTUs的数量接近于饱和,能充分展示连栀矾溶液的真菌群落结构,其主要由子囊菌门(Ascomycota,74.21%)、担子菌门(Basidiomycota,7.31%)、罗兹菌门(Rozellomycota,2.62%)、接合菌门(Zygomycota,0.66%)和球囊菌门(Glomeromycota,0.01%)组成,优势菌门为子囊菌门。通过分析OTUs数量、chao1指数,ACE指数、Shannon指数,表明连栀矾溶液真菌菌群有较高的丰富度和多样性,并且在炮制过程中上下层总丰富度和多样性随发酵时间的增加逐渐增加,其中上层样品的丰富度、多样性逐渐增加,下层样品的丰富度、多样性先降低后增加,且上层样品的丰富度、多样性明显高于下层样品。结论以高通量测序技术分析连栀矾溶液发酵炮制过程中真菌菌群结构、多样性及丰富度的动态变化可为指导其科学发酵提供参考。     

湖北利川黄连不同生长龄期主要生物碱的分布及变化

目的:研究湖北利川黄连不同生长龄期主要生物碱的累积变化过程,为标准化种植提供科学依据.方法:采用紫外分光光度法和HPLC测定黄连有效成分.结果:随着生长龄期的增长,黄连叶片数、根茎干重都在不断的增加;黄连不同部位中总生物碱含量的由大到小的顺序依次是根茎＞须根＞叶片;在黄连2～3龄阶段为黄连生长最旺盛的时期,酪氨酸、总生物碱、小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量增长速度最快;在5龄阶段,这4种生物碱含量的大小顺序依次是小檗碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀,且这4种生物碱含量之和占总生物碱含量的比例在不断增加.结论:为黄连的种植管理提供了参考.     

不同生长年限党参根系微生物群落结构和多样性研究

目的 探究不同生长年限党参Codonopsis pilosula根系微生物群落结构变化及其与土壤环境因子的相关性,以提高党参品质。方法 对一、二、三年生党参土壤、根际土壤和根进行高通量测序和生物信息学分析。结果 随党参生长年限的增加,土壤和根际土壤中优势细菌Arthrobacter处于动态平衡,而根内细菌Ralstonia丰度减少。真菌Mortierella在土壤和根际土壤中丰度逐年降低,病原真菌Fusarium在党参根系中丰度逐年增加。不同生长年限的党参根系微生物群落组装更多的受随机性过程影响,且根系细菌的群落功能稳定性高于真菌。蛋白酶（protease,PRO）、全氮（total nitrogen,TN）、速效钾（available potassium,AK）、水分（water content,WC）、速效磷（available phosphorus,AP）和土壤有机质（soil organic matter,SOM）是影响不同生长年限党参根系细菌群落结构和多样性的主要影响因素,TN和全钾（TK）是影响真菌群落结构和多样性的主要影响因素。结论 党参根系微生物群落组成和多样性随生长年限改变,并对不同土壤环境因子作出差异化响应,该研究为后期深入研究党参病害防治,提高党参品质提供理论基础。     

基于高通量测序研究番红花不同生长期根际土壤中真菌群落结构及多样性

目的 以新疆番红花Crocus sativus L.不同生长期的根际土壤为材料,研究土壤真菌群落结构与多样性。方法 提取番红花不同生长期的根际土壤总DNA,应用Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台进行测序分析。结果 对番红花3个生长期[生长初期（S1）、生长中期（S2）、生长后期（S3）]的3组样本进行高通量测序,共获得4252个操作分类单元（OTUs）,包含9个真菌门,并对检测到的真菌属中相对丰度前20的真菌属进行了分析。结果发现,不同生长期番红花优势真菌群落共有门属分别是子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、链格孢属（Alternaria）、球腔菌属（Mycosphaerella）和爪甲白癣菌属（Arthrographis）。3个生长期的真菌组成有所不同,S1和S2生长期特有的属分别是平脐蠕孢属（Bipolaris）和谷菌根菌属（Archaeorhizomyces）,S3有2个特有的属和1个特有的门,分别是棘壳孢属（Setophoma）、枝孢属（Cladosporium）和油壶菌门（Olpidiomycota）。Alpha和Beta多样性分析结果表明,不同生长期番红花根际土壤真菌群落赵氏指数（Chao1）、香农指数（Shannon）和观察到的种类数（Sobs）差异有统计学意义,样本中真菌物种组成存在一定差异。结论 利用高通量测序技术可快速、全面地获得土壤真菌组成信息。番红花不同生长时期根际土壤中真菌群落结构与多样性存在差异,菌群多样性随番红花的生长呈现不断上升的趋势;在番红花不同的生长期尤其是S1土壤样本中均检测到相对丰度较高的有害菌链格孢菌属和被孢霉门。为进一步揭示新疆番红花S1易发生种球腐烂病害,以及根际真菌的多样性与番红花球茎内生真菌、病原菌相互作用机制研究提供新思路。     

不同海拔高度与不同株龄和月份对黄连质量和产量的影响

目的 分析不同海拔高度黄连的质量和产量随株龄和月份的变化规律。方法 采用烘干称重法和比色法分别测定不同海拔高度下不同龄期和月份的黄莲根状茎重量和小檗碱含量。结果 生长在低海拔地区的黄连产量和质量地高海拔地区；黄连根状茎重量在第5年达到最大，而小檗碱含量在第6年达到最高；7月份是黄连根状茎重量和小檗碱含量在一年中最高的月份。结论 研究结果可为黄链生产和最佳收获期的确立提供科学依据。     

黄连须根浸提液对土壤微生物及酶活性的影响

黄连Coptis chinensis是大量使用的中药材,连作障碍严重。试验在供试土壤中加入不同浓度的黄连须根浸提液(REC),研究了它们对土壤微生物和酶活性的影响。结果表明,在加入REC的土壤中,微生物碳氮量显著降低,细菌和放线菌比对照降低约60%,但真菌增加3倍左右。自生固氮菌、磷细菌、钾细菌、硝化细菌和氨化细菌均显著减少,说明土壤固(供)氮、溶磷、解钾、促生等功能受到抑制。REC对土壤酶活性的影响表现出多样性,提高转化酶活性,降低脲酶活性,对脱氢酶活性无显著影响,妨碍了土壤生物化学反应的有序进行。此外,REC减少微生物标记性磷脂脂肪酸(PLFAs)种类,降低PLFAs总量,提高真菌/细菌PLFAs比值,说明REC在抑制细菌繁殖生长的同时,相对的增加了真菌数量,致使后续作物容易发生真菌病害。REC还显著降低土壤微生物群落的多样性和均匀度指数,说明加入REC恶化了土壤生态环境,使微生物种群减少,密度降低。因此,在黄连生长过程中,根系分泌的化感物质可能改变土壤微生物种群结构,造成连作障碍。     

基于网络药理学对黄连抗结直肠癌作用机制的分析＊

目的基于网络药理学分析方法探讨黄连抗结直肠癌的物质基础和作用机制。方法通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、中医药整合药理学研究平台(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP)及文献检索收集黄连的主要活性成分,并利用PubChem得到其活性成分的结构信息。采用SwissTargetPrediction数据库检索活性成分作用靶点,在GeneC ards和Open Targets数据库检索结直肠癌疾病相关靶点,并与活性成分靶点取交集作为黄连治疗结直肠癌的潜在作用靶点,导入Cytoscape构建黄连活性成分-结直肠癌疾病靶点网络图。利用STRING构建靶蛋白互作网络。根据拓扑分析筛选黄连治疗结直肠癌的关键药效成分与核心靶点。应用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)数据库对核心治疗靶点进行GO生物学功能及KEGG通路富集分析。结果黄连62个活性成分通过调控91个结直肠癌相关的疾病靶点,产生了134对化合物-靶点关系,其中黄酮醇类(如槲皮素)和生物碱类(如小檗碱)均发挥了中药作用,参与了体内细胞对化学压力的反应、氧化应激、磷酸化、蛋白激酶B信号传导等生物过程,干预PI3K-AKT、蛋白聚糖、Ras、Rap1、ErbB、HIF-1、FoxO、VEGF、花生四烯酸代谢等信号通路发挥抗结直肠癌的作用。结论黄连中的黄酮醇类和生物碱类等多成分,可通过多靶点、多通路协同发挥抗结直肠癌的作用,CA1、CA12、CA2、CA9、AKT1、EGFR、PTGS2和SRC等可能是其核心治疗靶点,PI3K-AKT、Ras、Rap1和VEGF等可能是其主要作用通路。     

重楼根际及药用部位内生真菌多样性与群落结构差异分析

目的寻找能促进宿主植物活性代谢产物合成的微生物,为后续功能菌群的建立及功能基因的发掘,提供理论支持。方法应用IlluminaMiseqPE250高通量测序技术对重楼根际土壤真菌、根及根茎内生真菌ITS1区进行序列测定,并进行生物信息学分析。结果测序结果共获得154228条序列,这些序列对应的根际土、根茎、根分别被聚类为408、119、57个OTUs。结论重楼根际及内生真菌多样性的关系为根际土根茎根,在重楼药用部位根茎中发现Mucoromycota门较非药用部位根中的门为特有门,Ascomycota门为优势门,Roseodiscus属真菌为重楼根茎内生真菌优势菌群,根茎和根部的特有种群及优势菌群可能与重楼活性产物合成密切相关。